报告基因工具鼠如何精确标记目的细胞？——嵌套报告基因系统详解

在谱系示踪研究中，基因异位表达会干扰细胞命运追踪的准确性。嵌套报告基因系统是一种双重组酶介导的遗传标记方法，通过将内部重组位点"嵌套"在外部重组位点之中，实现对 A⁺B⁻ 细胞的精确标记，同时将异位表达的细胞标注为不同颜色加以排除。本文详细解析嵌套报告基因系统的原理、实际案例及与独家报告系统的对比选择策略。

目录

嵌套报告基因系统的结构与原理

三种细胞类型的标记结果

嵌套系统如何避免异位表达

案例：Sox9⁺ 胆道上皮细胞的精确标记

嵌套 vs 独家报告系统对比

如何选择双报告系统

1. 嵌套报告基因系统的结构与原理

在遗传谱系追踪实验的设计过程中，基因的异位表达往往是需要着重关注的问题。目的启动子在非目的组织中的表达被称为异位表达。为了更精准地标记特定细胞类型、避免异位表达的影响，我们可以借助两个（甚至以上）的标记物进行标记，这时就需要使用多重组酶介导的遗传方法。

图1. 异位表达对谱系示踪的影响 [1]

上一期，我们讲述了双重组酶介导的独家报告基因类型，这种类型常用于标记 A⁺B⁻（反之亦然）的细胞类型，但其标记存在先后顺序的限制。本期鼠博士来讲述另一种常用的标记 A⁺B⁻ 的报告系统——嵌套报告基因系统。

谱系示踪系列课程往期回顾：

【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式

【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法

【谱系示踪系列第三期】多重组酶介导的交叉报告基因方法

谱系示踪的难点——基因标记的异位表达如何避免？（上）

嵌套报告基因系统的结构是：

Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B

这类系统利用两个重组系统，将一对识别位点放置于另一对识别位点与报告基因的两端，形成一个重组系统包裹着另一个重组系统的嵌套结构。

核心逻辑：

如果内部的重组系统发生重组后，外部的重组系统仍然可以发生第二次重组；

但外部重组系统发生重组时，内部的序列全部被切除，无法进行再次重组。

2. 三种细胞类型的标记结果

图2. 嵌套报告基因小鼠的基因重组图解 [1]

· A⁺B⁻ 细胞： MarkerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 Stop 序列被切除）。系统表达绿色荧光 ZsGreen。

· A⁺B⁺ 细胞： MarkerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶切除两个 Rox 位点之间的序列（ZsGreen、一对 loxP 位点与全部 Stop 序列被切除），系统表达红色荧光 tdTomato。

· A⁻B⁺ 细胞： MarkerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶切除两个 Rox 位点之间的序列（ZsGreen、一对 loxP 位点与全部 Stop 序列被切除），系统表达红色荧光 tdTomato。

结果：A⁺B⁻ 细胞标记为绿色。A⁻B⁺ 细胞、A⁺B⁺ 细胞标记为红色。

3. 嵌套系统如何避免异位表达

若我们想标记 MarkerA 的细胞，启动子 A 介导的 Cre-loxP 内部重组可使 A⁺ 细胞呈绿色。然而，如果启动子 A 在"不需要的"B 类型细胞（A⁺B⁺ 细胞）中也被激活，由于 B 类型细胞中特定启动子 B 驱动的外部 Dre-Rox 重组已经去除 ZsGreen 基因，这部分"不需要的"A⁺B⁺ 细胞仍呈现红色。

通过使用嵌套报告基因系统将异位表达的细胞标记为其他颜色，从而排除 MarkerA 异位表达的影响。 这正是这类报告基因工具鼠在精准谱系示踪中的核心价值。

4. 案例：Sox9⁺ 胆道上皮细胞的精确标记

Sox9⁺ 胆道上皮细胞（BEC）是否在肝脏再生过程中形成肝细胞仍然存在争议。一些谱系追踪研究报告说，Sox9-CreER 标记的 BEC 可能有助于体内平衡和损伤后的肝细胞生成；其他研究则报告说，新产生的肝细胞来源于损伤后预先存在的肝细胞。

核心问题： Sox9 在 BEC 和一些门脉周围肝细胞中均有表达，这导致使用传统的 Sox9-CreER 转基因小鼠进行标记不够准确——追踪到的新肝细胞可能来自 Sox9-CreER 标记的预先存在的肝细胞。

图3. 使用传统方法标记 Sox9⁺ 细胞无法准确标记 BECs [2]

解决方案： 利用肝细胞特异性标记白蛋白 Alb-DreER 转基因小鼠与嵌套报告基因系统可区分 Sox9⁺ BEC 和 Sox9⁺ 肝细胞：

Sox9⁺ BEC 被标记为绿色

Sox9⁺ Alb⁺ 肝细胞被标记为红色

Alb⁺ 肝细胞也被标记为红色

至此，精确标记的 ZsGreen⁺ BEC 和 tdTomato⁺ 肝细胞可用于重新评估 Sox9⁺ BEC 在肝脏修复过程中对肝细胞的贡献。针对肝损伤后的小鼠进行荧光检测分析表明，BEC 不会再生新的肝细胞，而只是在 CCl₄ 诱导的肝损伤后增殖以补充 BEC。

图4. 嵌套报告基因系统准确标记 BECs [1]

5. 嵌套 vs 独家报告系统对比

嵌套报告基因系统（Nested Reporter Systems）

图5. 嵌套报告基因系统结构图

结构：Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B

可用于破解具有已知阳性和阴性 Marker 的干细胞命运

Dre-Rox 和 Cre-loxP 的重组顺序不会影响最终结果

更适合使用双诱导型重组系统

独家报告基因系统（Exclusive Reporter Systems）

图6. 独家报告基因系统结构图

结构：Rosa26-CAG-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B

可用于破解具有已知阳性和阴性 Marker 的干细胞命运

标记存在先后顺序，相反的先后顺序会极大影响标记结果

建议两个重组酶中一种采用可诱导类型的重组酶

6. 如何选择双报告系统

选择哪种双报告系统取决于是否需要控制 A&B 表达重组酶的时间，以及重组酶的类型选择。

情况一：A&B 不仅在目的组织中特异性表达，也在发育期/干细胞期广泛表达

由于 A、B 表达位置存在发育期表达的干扰，需控制 A、B 蛋白的表达时间：

· 仅需控制单个 Marker 的表达时间： 以 MarkerA 需控制为例，A 需使用可诱导重组酶。此时 B 可选择可诱导的或组成型的——如果选择组成型，请确保 A 和 B 发生的重组顺序正确，可选择独家报告系统；如果选择可诱导的，则需选择嵌套报告系统。

· 需控制双个 Marker 的表达时间： A 与 B 都需要选择可诱导的重组酶，这时需选择嵌套报告系统。

情况二：A&B 仅在目的组织中特异性表达，不会在发育期/干细胞期表达

无需调控 A&B 的表达时间，选择哪种双报告系统取决于重组工具的类型——如果 B 介导的是组成型、A 介导的是诱导型，可选择独家报告系统；如果 A 和 B 都是可诱导的，可选择嵌套报告系统。

7. 小结

多重组酶介导的遗传方法增强了细胞命运图谱的特异性和精确性，从而可以在生物过程中发现前所未有的细胞事件。策略的选择主要取决于基因表达、可用的工具小鼠和要解决的科学问题。在避免基因异位表达方面，我们不仅可以在报告基因工具鼠方面做文章，还可以针对重组酶进行设计。

Reference：

[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424.

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