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南模生物模型鼠助力王福俤/闵军霞等团队研究获得新突破


Blood: 南模助力王福俤/闵军霞/郑树森院士团队在肝纤维化及肝硬化防治领域获得重大突破

肝脏纤维化是多种致病原因所致的慢性肝脏损伤后发生的肝内结缔组织异常增生性疾病,长期发展会导致肝硬化,是一种世界范围内较为常见的致死病因。目前,除肝脏移植外,针对肝纤维化及肝硬化尚缺乏有效治疗措施【2】。

因此,早期发现及预防肝损伤、肝纤维化及肝硬化的发生对于改善肝脏疾病的转归及预后至关重要。

近日,国际权威学术期刊《血液学》(Blood,影响因子16.6)在线发表了浙江大学医学院王福俤教授、闵军霞教授和郑树森院士团队合作研究新成果。

论文题目为 “Hepatic Transferrin Plays a Role in Systemic Iron Homeostasis and Liver Ferroptosis”【1】(图1)。

该成果系统揭示并阐明肝脏转铁蛋白(Transferrin, Trf)通过调控铁死亡抑制肝脏损伤、纤维化及肝硬化发生的功能及致病分子机制。

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图1. Online发表论文首页

南模生物为该研究构建了Trffl/+小鼠模型。

该研究通过在国际上率先构建的肝实质细胞特异敲除转铁蛋白基因的小鼠模型,展现出机体组织铁蓄积、铁死亡及肝纤维化的系列典型病理特征;并进一步功能筛选发现金属膜蛋白Slc39a14(Zip14)是转铁蛋白缺失引发的组织器官铁蓄积的关键转运蛋白;阐明敲除Slc39a14能够完全逆转非转铁蛋白结合铁(NTBI)蓄积以及肝细胞铁过载导致的肝细胞铁死亡和肝纤维化。

该重大研究成果不仅为防治肝损伤、肝纤维化及肝硬化等疾病提供了新靶点(转铁蛋白及Slc39a14),而且为进一步深入研究肝纤维化及肝硬化的致病机制提供了新思路。

为了研究转铁蛋白在肝脏组织中的功能,研究者首先利用Cre/loxP技术构建了编码转铁蛋白(Transferrin, Trf)基因的肝实质细胞特异性敲除小鼠(Trf-LKO)。研究发现肝实质细胞特异敲除Trf后,小鼠铁调素Hepcidin表达水平下降,全身铁代谢发生明显紊乱;小鼠主要表现为造血异常、血清中NTBI水平急剧升高同时伴随肝脏中铁离子蓄积,并在6-12月龄时观察到肝脏脂质过氧化损伤。

进一步在高铁饲喂以及慢性四氯化碳注射的两种常用肝纤维化动物模型中,研究者们发现肝实质细胞特异性敲除Trf小鼠出现严重肝纤维化的表现,并伴随肝脏脂质过氧化损伤增强、铁死亡调控基因表达异常。

这些数据提示铁死亡在低转铁蛋白相关的肝纤维化发生中可能发挥作用。

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图2: 肝脏Trf敲除小鼠发生肝纤维化

进一步探索机制过程中,研究人员给上述疾病模型小鼠腹腔注射铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1),发现Fer-1治疗组小鼠的肝纤维化表型明显缓解,表明细胞铁死亡是低转铁蛋白相关的肝纤维化发生的关键致病机制。

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图3.铁死亡抑制剂有效逆转肝脏纤维化

接下来的关键科学问题是:在肝脏缺乏转铁蛋白时,为什么NTBI会进入肝脏并在肝脏蓄积?

通过对Trf-LKO小鼠金属转运蛋白的筛选,研究人员锁定金属离子转运蛋白Slc39a14。有趣的是,王福俤团队前期曾报道该蛋白在生理条件下主要转运锰离子【3】。

为明确这一关键问题,研究团队在国际上首次成功制备了肝实质细胞特异性敲除Trf和Slc39a14的双基因敲除小鼠模型(DKO),并且惊喜地发现,抑制Slc39a14的表达能明显改善肝脏NTBI的蓄积,并显著减轻脂质过氧化及铁死亡引发的肝损伤,从而成功逆转了肝实质细胞Trf敲除小鼠的铁死亡及其诱发的肝纤维化。

这些结果不仅进一步明确了NTBI蓄积是诱发肝脏铁死亡的分子机制,同时提示Slc39a14有望成为治疗低转铁蛋白及铁死亡相关肝脏疾病的重要靶点。

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图4.肝实质细胞特异敲除Slc39a14逆转Trf缺失导致的肝脏纤维化

小鼠的这些系列发现是否与临床相关疾病有关?为了进一步探究临床患者转铁蛋白与肝纤维化关联特征,研究人员通过分析肝硬化患者和正常健康对照的血清学指标,发现肝硬化患者的血清转铁蛋白水平显著低于健康对照人群;并且肝硬化患者的肝纤维化四项与血清转铁蛋白水平之前存在显著负相关。

这些临床相关分析进一步提示转铁蛋白缺乏在肝纤维化/肝硬化的发生发展中可能扮演重要角色。

此外,基于肝硬化患者的肝穿样本的检测结果,发现肝硬化患者的肝脏转铁蛋白水平明显减少,而肝脏铁水平及SLC39A14蛋白表达水平明显增高,进一步表明转铁蛋白缺乏的肝纤维化/肝硬化患者可能通过SLC39A14吸收NTBI,随后激发了脂质过氧化性肝损伤、肝纤维化及肝硬化。这些数据提示抑制铁死亡或SLC39A14有望成为潜在的防治肝硬化的治疗方式。

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图5. 肝硬化患者转铁蛋白缺乏及脂质过氧化损伤


结论

总之,该重大成果的主要突出贡献为:

(1)首次成功制备转铁蛋白组织特异性敲除小鼠模型,为研究转铁蛋白的组织来源及功能提供新型动物模型;

(2)阐明了肝脏转铁蛋白缺乏通过铁死亡促发肝纤维化的分子机制;

(3)首次明确SLC39A14是组织器官铁离子过载的转运蛋白,解析了困扰科学界半个多世纪的难题;

(4)阐明补充转铁蛋白以及抑制铁死亡或SLC39A14能够有效预防及缓解肝纤维化发生发展,为肝纤维化及肝硬化的防治提供了重要新靶点。

该成果不仅丰富和阐明肝脏疾病铁死亡发生的分子调控机制,同时为肝脏疾病诊治提供了新靶点和新策略。

图666.png

图6.论文模式图


Advanced Science:南模助力王福俤/闵军霞/谢黎炜团队合作揭示转铁蛋白受体调控脂肪细胞产热及细胞命运的新机制


脂肪组织是参与调控全身能量代谢的重要器官,主要由三种脂肪细胞构成:白色、棕色和米色。白色脂肪用于贮存能量,而棕色脂肪用于消耗能量,通过非战栗性产热来维持体温恒定。活化棕色脂肪有助于机体抵抗能量摄入过多引起的脂肪堆积,从而抑制肥胖的发生[5]。米色脂肪是近年来新发现可以被冷刺激或β3-肾上腺素受体激动剂诱导形成的一种产热脂肪,在治疗肥胖及相关代谢性疾病方面有极好的应用前景[6]。

通过深入了解白色脂肪米色样变及棕色脂肪形成和活化的分子调控机制,对于靶向干预促进棕色/米色脂肪产热具有重要的理论和实践意义。

微量元素铁在维持营养和能量代谢平衡中扮演重要角色[7]。脂肪细胞铁稳态代谢的研究多集中在白色脂肪。在白色脂肪细胞分化过程中,通过DFO螯合细胞中铁离子或者敲降转铁蛋白(Tf)可以显著抑制脂合成[8];添加铁和Tf可以促进脂肪细胞脂解[9],抑制胰岛素刺激的葡萄糖吸收[10]。

遗传性低铁模型Tmprss6敲除小鼠脂肪组织铁含量减少,白色脂肪脂解增加,从而抵抗高脂膳食诱导的肥胖[11]。然而,铁稳态代谢对棕色脂肪细胞分化产热以及白色脂肪米色化的调控作用及其分子机制尚待深入研究。

4月24,来自浙江大学医学院王福俤和闵军霞团队,以及广东省微生物研究所谢黎炜团队在国际著名学术期刊Advanced Science(影响因子15.804)发表题为“Transferrin Receptor 1 Regulates Thermogenic Capacity and Cell Fate in Brown/Beige Adipocytes”的研究论文[4]。表明转铁蛋白受体(Transferrin Receptor 1, Tfr1)通过特异机制调控棕色/米色脂肪细胞功能和发育。在米色脂肪形成过程中,活化的缺氧诱导因子HIF1α通过转录调控Tfr1表达促进铁吸收从而维持线粒体功能;在棕色脂肪发育过程中,Tfr1以非铁依赖的方式调控棕色脂肪与白色脂肪、肌细胞的转分化。

图777.jpg

南模生物为该研究构建了Tmprss6fl/fl小鼠模型。

研究人员在β3肾上腺素激动剂CL-316,243诱导米色脂肪形成的小鼠模型上,通过H3K9/14Ac ChIP-seq、RNA-seq和iTRAQ膜蛋白质组等多种组学技术发现铁稳态代谢被明显富集,并筛选出转铁蛋白受体Tfr1表达显著上调。

随后发现Tfr1脂肪特异性敲除(Tfr1Adp/Adp)小鼠对冷不耐受,冷诱导的米色脂肪细胞形成被抑制,冷诱导的棕色脂肪产热和脂解减少,线粒体形态和铁稳态代谢异常(图一)。

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图1:Tfr1脂肪特异性敲除小鼠棕色/米色脂肪功能异常

在高脂膳食(HFD)诱导的肥胖模型下,Tfr1敲除虽然不影响食欲和体重,但是可加剧HFD诱导的脂代谢紊乱、胰岛素抵抗和脂肪组织炎症。

随后,研究人员对米色脂肪形成过程中Tfr1表达上调的分子机制进行了研究,发现缺氧诱导因子HIF1α蛋白表达和入核活化明显增加,棕色脂肪特异性敲除Hif1α (Hif1aUcp1/Ucp1)小鼠表现出冷诱导的米色脂肪生成被抑制,而棕色脂肪却未见明显改变。

通过Chip-qPCR实验发现冷刺激可以诱导米色脂肪HIF1α与Tfr1 启动子结合促进其转录。

以上结果提示冷刺激诱导HIF1α活化,通过转录调控Tfr1表达控制铁吸收从而促进白色脂肪米色化。

为了解析Tfr1敲除导致棕色脂肪功能异常的机制,研究人员通过转录组分析发现Tfr1敲除可以明显增加干细胞、白色脂肪细胞和肌细胞标志基因表达,并对这些基因表达进行验证。从而表明Tfr1在棕色脂肪细胞命运决定中扮演重要角色。

然而这一作用与Tfr1敲除造成的低铁状态无关,因为无论是遗传性低铁(Tmprss6-/-)小鼠模型还是孕期低铁饲喂均不能模拟Tfr1敲除引起的棕色脂肪细胞向肌细胞转分化,表明Tfr1可能通过非铁依赖的作用调控棕色脂肪细胞分化。

然而Tmprss6-/-小鼠冷诱导的米色脂肪生成被抑制,表明铁稳态在白色脂肪米色化过程中起重要作用。Tfr1如何通过铁依赖与非铁依赖作用调控棕色/米色脂肪细胞产热和分化仍待进一步研究。

图999.png

图2:Tfr1调控棕色/米色脂肪细胞产热和分化的模式图


结论

总之,该成果发现Tfr1和铁稳态代谢在调控棕色和米色脂肪细胞产热和命运决定中的关键作用,并从机制上揭示了冷刺激诱导活化的HIF1α通过转录调控Tfr1促进白色脂肪米色化,这一重大发现将为脂肪细胞生理和机体铁稳态代谢提供新的认识,为肥胖及相关代谢性疾病机制探索和靶向治疗提供新的方向和思路。


以上内容转自公众号营养发现


References

【1】Yingying Yu#, Li Jiang#, Hao Wang, Zhe Shen, Qi Cheng, Pan Zhang, Jiaming Wang, Qian Wu, Xuexian Fang, Lingyan Duan, Shufen Wang, Kai Wang , Peng An, Tuo Shao, Raymond T Chung, Shusen Zheng*, Junxia Min*, Fudi Wang*(王福俤).Hepatic Transferrin Plays a Role in Systemic Iron Homeostasis and Liver Ferroptosis. Blood. doi: 10.1182/blood.2019002907. Online ahead of print.

【2】Vilar-Gomez E, Calzadilla-Bertot L, Wai-Sun Wong V, Castellanos M, Aller-de la Fuente R, Metwally M, Eslam M, Gonzalez-Fabian L, Alvarez-Quinones Sanz M, Conde-Martin AF et al: Fibrosis Severity as a Determinant of Cause-Specific Mortality in Patients with Advanced Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Multi-National Cohort Study. Gastroenterology 2018, 155(2):443-457.e417.

【3】Yongjuan Xin#, Hong Gao#, Jia Wang#, Yuzhen Qiang, Mustapha Umar Imam, Yang Li, Jianyao Wang, Ruochen Zhang, Huizhen Zhang, Yingying Yu, Hao Wang, Haiyang Luo, Changhe Shi, Yuming Xu, Shintaro Hojyo , Toshiyuki Fukada, Junxia Min, Fudi Wang*(王福俤). Manganese transporter Slc39a14 deficiency revealed its key role in maintaining manganese homeostasis in mice.Cell Discovery 2017; 3:17025.

【4】Fisher FM, Kleiner S, Douris N, Fox EC, Mepani RJ, Verdeguer F, Wu J, Kharitonenkov A, Flier JS, Maratos-Flier E, Spiegelman BM. FGF21 regulates PGC-1alpha and browning of white adipose tissues in adaptive thermogenesis. Genes & development 2012, 26(3): 271-281.

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【7】Liu X, Perusse F, Bukowiecki LJ. Mechanisms of the antidiabetic effects of the beta 3-adrenergic agonist CL-316243 in obese Zucker-ZDF rats. The American journal of physiology 1998, 274(5): R1212-1219.

【8】Blankenhaus B, Braza F, Martins R, Bastos-Amador P, Gonzalez-Garcia I, Carlos AR, Mahu I, Faisca P, Nunes JM, Ventura P, Hoerr V, Weis S, Guerra J, Cardoso S, Domingos A, Lopez M, Soares MP. Ferritin regulates organismal energy balance and thermogenesis. Molecular metabolism 2019, 24: 64-79.

【9】Seale P, Bjork B, Yang W, Kajimura S, Chin S, Kuang S, Scime A, Devarakonda S, Conroe HM, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Rudnicki MA, Beier DR, Spiegelman BM. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature 2008, 454(7207): 961-967.

【10】Ohno H, Shinoda K, Ohyama K, Sharp LZ, Kajimura S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature 2013, 504(7478): 163-167.

【11】Dempersmier J, Sambeat A, Gulyaeva O, Paul SM, Hudak CS, Raposo HF, Kwan HY, Kang C, Wong RH, Sul HS. Cold-inducible Zfp516 activates UCP1 transcription to promote browning of white fat and development of brown fat. Molecular cell 2015, 57(2): 235-246.



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