这些动物模型，为小核酸药物再添一场东风
经过几十年的发展，小核酸药物终于逐步走向舞台中央——2023年诺贝尔生理学或医学奖肯定了核酸药物的前景；2024年国产小核酸药物的数起融资及收购在经济下行的当下更显耀眼。预计到2025年，小核酸药物的市场规模将达到100亿美元。
目前，全球范围内有近200个核酸药物处于临床试验阶段，主要用于治疗肝部、眼部、皮肤、神经系统疾病、肿瘤等领域。从所属管线看，目前小核酸药物研发的重点已经从罕见病拓展至糖尿病、乙肝等慢性病领域，而国内则基本直接跳过了罕见病小核酸药物的开发，着重发力在糖尿病、降血脂等市场潜力巨大的病种上，比如瑞博生物和BI合作开发的关于治疗非酒精性或代谢功能障碍相关脂肪性肝炎小核酸创新疗法。
1 小核酸药物简介
小核酸药物可以分为反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、miRNA、寡核苷酸适配子、CpG寡核苷酸等，它们的作用机制大都是相似的，通过与mRNA互补配对来发挥功能，而核酸适配体的作用机制则比较独特，它们各自的具体机制如下：
miRNA药物：
其机制是部分链的配对，与siRNA不同，miRNA只是在种子区的几个碱基进行配对，所以miRNA可以调控多个分子。
RNAi药物：
合成短双链RNA，进入细胞后正义链被降解，反义链与多蛋白组分形成RISC复合体，RISC中保留的反义链与靶基因的mRNA特异地互补，同时RISC具有核酸酶活性，能将靶基因的mRNA切割降解或抑制其翻译活性。
ASO药物：
合成15-30nt的单链DNA或RNA，该序列进入细胞后与靶标mRNA结合，抑制mRNA翻译或诱发mRNA降解。
核酸适配体：
核酸适配体是折叠成独特的三维结构的短单链寡核苷酸，利用其三维结构特异性结合较大范围的目标，包括蛋白质、小分子、金属离子、病毒、细菌和全细胞，其高特异性和结合亲和力可达到抗体水平。与抗体相比，核酸适配体具有体外筛选快速、可无细胞化学合成以及体积小，具有较低免疫原性和较强组织穿透力等优势。
图2.ASO和RNAi机制模式图
2 小核酸药物的递送系统
小核酸药物设计原理很简单，但它们都需要被递送到靶点细胞内发挥作用，而且不能激发有害免疫反应。递送技术是小核酸药物成败的关键所在，也是一个专利壁垒遍布的领域，迄今为止，科学家们已经开发出多种RNA递送技术，它们可以分为2大类：一是化学修饰技术，通过改造核酸分子提高其稳定性，并避免免疫系统的识别；二是递送载体，递送载体可以使核酸免受血清核酸酶活性和免疫成分的影响，而且可以决定药物的生物分布[1]。
化学修饰技术
化学修饰技术主要应用于分子量较小的RNA分子，它们包括siRNA、反义寡核苷酸（ASO）等。通过在特定位置进行化学修饰，提高这些小核酸分子的稳定性、避免激发免疫系统反应，并利用真核细胞中已有的酶来行使它们的功能。如GalNac(N-乙酰化的半乳糖胺)修饰，通过将GalNac以三价态的方式共价偶联至核酸3’末端构成，这是当前小核酸药物递送最常用的系统之一。肝脏表面的受体CDR可以结合血液中的乳糖，并通过胞吞吸收，GalNac是与CDR结合能力最强的一种乳糖类似物，高度靶向肝细胞，递送效率很高。
图3.ASO, siRNA等小分子量RNA疗法
基于脂质的递送系统
基于脂质的递送系统包括胶束（micelles），脂质体（liposome）和脂质纳米颗粒（LNP），是使用最早也是当前最成熟的递送系统。RNA带负电，带正电的脂质会和它结合，形成很小的反向交错结构的粒子，外面再包裹磷脂，形成的脂质复合体可以将携带的RNA递送到目的组织。由于肝脏是脂质代谢的中心，这种递送系统在肝脏上的应用最为成熟，目前已有上万种结构迥异的脂质递送系统被创建出来，在小鼠模型中，现在向肝脏递送的siRNA所需的剂量已经可以做到比初代递送系统低500多倍。
图4.基于脂质的RNA递送系统
此外，改变LNP的脂质组分或者添加新的脂质分子，可以促进LNP递送到肝脏以外的组织。Intellia Therapeutics和Beam Therapeutics公司都已经分享了将mRNA递送到造血干细胞和祖细胞中的LNP信息，它们带来了开发靶向体内造血干细胞疗法的希望。
基于聚合物的纳米颗粒
很多非病毒递送系统可以使用聚合物和基于聚合物的纳米颗粒，通过调节聚合物的极性、降解性和分子量，可以改变聚合物递送RNA进入细胞的效率。比如，通过携带胺基让聚合物呈阳性，提高聚合物与RNA分子的结合能力；通过让聚合物分子携带可被生物降解的酯键，可以降低聚合物的细胞毒性。
图5.基于聚合物的RNA递送系统
还有一类可以用来递送RNA的聚合物称为树枝状大分子（dendrimers），它们以一个核心分子为中心，通过聚合反应重复增长合成树枝状的聚合物，树枝上修饰有阳离子基团，可以与带负电RNA生成复合物。这种结构可以将RNA递送到中枢神经系统，将siRNA递送到肝脏内皮细胞中，还能用于肌肉注射，并且这种树枝状大分子的结构可不易被降解，可以增加给药间隔。
图6.适合在临床环境下使用的递送系统的特征
递送系统是小核酸药物开发的关键所在，一款成功的递送系统通常需要具有以下特征：安全性高，可以在体内生物降解；特异性高，脱靶率低；疗效高，毒性低，重现性好等。
3 小核酸药物研究相关动物模型
3.1心血管疾病
不同于罕见病的无药可治，市面上通过降血脂改善心血管疾病症状的药物并不少，但长期用药容易引起患者内心的抵触，往往导致患者依从性低。小核酸药物可以极大的降低给药频率，可以很好的解决这个问题。目前，有多个以不同血脂类型为靶点的小核酸药物正在研发中，包括靶向PCSK9的小核酸药物、靶向Lp(a)的小核酸药物、靶向富含甘油三酯脂蛋白的小核酸药物等[3]。
图7.代谢紊乱类小核酸药物主要靶点
PCSK9人源化小鼠模型
PCSK9可与低密度脂蛋白受体（LDLR）结合，并将LDLR转移至溶酶体内破坏，增加了LDLR的降解，进而促使循环中LDL-C水平升高[4]。2021年12月， PCSK9 siRNA药物Leqvio（inclisiran）获FDA批准上市，实现一年两针的用药频率，可持续有效降脂，是心血管领域的第一个小核酸药物。南模生物自主研发了PCSK9人源化小鼠模型，可用于PCSK9靶向药物的筛选及临床前药效验证。
图8.全人源化抗体evolocumab(PCSK9抑制剂)显著改善PCSK9人源化小鼠血脂水平
LPA人源化小鼠模型
Lp（a）具有促动脉粥样硬化、促炎和促血栓形成作用，被认为是心血管疾病的遗传性、独立因果风险因素。目前尚无针对Lp（a）的获批临床药物，靶向于Lp（a）的小核酸药物将有望成为首个可有效降低Lp（a）的药物。目前Olpasiran（AMG890和SLN360）对于降低Lp（a）的安全性及有效性的研究均在进行，初步结果均显示具有较好的安全性及有效性，有望拔得头筹。南模生物针对小核酸药物研发需要，自主开发了多种LPA人源化小鼠，满足客户不同研发需求。
图9.化合物单次给药后检测LPA血清蛋白水平及肝mRNA水平 (Data来自合作者）
ANGPTL3人源化小鼠模型
ANGPTL3是一种由肝脏合成的脂蛋白酯酶和内皮酯酶抑制剂，抑制ANGPTL3被证实可降低血清低密度脂蛋白（LDL）、血清和肝脏甘油三酯水平，是心血管疾病的一个新治疗靶点。Arrowhead公司的ARO-ANG3是一款靶向ANGPTL3的RNAi疗法，被开发用于治疗血脂异常、家族性高胆固醇血症，已进入临床III期。南模生物自主研发了ANGPTL3人源化小鼠模型，可用于相关药物的开发。
图10.hANGPTL3小鼠中hANGPTL3的表达水平
图11.雄性hANGPTL3小鼠（n=3）中的血清血脂水平
3.2补体系统疾病
补体系统是先天免疫系统的一部分，主要功能是通过溶胞，吞噬及介导炎症反应来清除入侵的病原体。补体系统的各成分可根据不同的生物学功能分为3类：补体固有成分（C2、C3、C5等）、补体调节蛋白（CI抑制物、I因子、H因子）和补体受体（CR1、CR2、CR3、CR4、CR5、C3aR等）。补体失效或过度激活也会导致多种疾病，如缺血性中风、脓毒症等急性炎症，牙周病、眼部疾病等慢性炎症，红斑狼疮等自身免疫性疾病；此外，一些肿瘤、肾病、神经退行性疾病、慢性溶血、血栓性微血管病等也与补体系统异常有关。
CFB人源化小鼠模型
图12.在单次给药试验药物（n=3）后，检测第7天剩余的肝CFB mRNA（A）和血清蛋白水平（B） (Data来自合作者）
C3人源化小鼠模型
图13.C3人源化纯合子小鼠门静脉区出现炎症和胆管增生等症状
图14.C3人源化纯合子小鼠出现肾小球硬化、肾小球萎缩和毛细血管丛区域炎症等症状
图15.C3人源化纯合子小鼠血生化检测（n=5）
3.3中枢神经系统疾病
由于血脑屏障（BBB）的存在，大部分治疗中枢神经系统药物无法穿过BBB 在脑内达到有效治疗浓度。因此深入研究血脑屏障上物质转运体，对寻找治疗中枢神经系统疾病的新药物作用靶点具有重要的意义。TFR1是一种单跨膜的细胞表面受体，主要通过结合转铁蛋白，将Fe离子转运进入细胞内，是细胞摄取铁的主要途径。通过将转铁蛋白与治疗药物、蛋白质结合，可以让TFR1成为向大脑定向运输大分子药物的“特洛伊木马”，对阿尔兹海默症、溶酶体贮积症、脑癌等多种脑部疾病的治疗都具有重要意义。
TFR1人源化小鼠模型
图16.免疫荧光法检测hTFR1小鼠内皮细胞中hTFR1的表达
图17.TFR1人源化小鼠中TFR1靶向治疗剂的体内评价。TFR1人源化小鼠通过i.v.注射用对照抗体（10mg/kg）和抗人TFR1的抗体（10mg/kg）。给药后18小时后采集脑组织和血清并检测。如图所示，TFR1结合抗体显示出较高的血清清除率和更高的脑暴露水平。(Data来自合作者）
3.4 ATTR相关疾病
转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）是由转甲状腺素蛋白（TTR）错误折叠导致其在组织中异常沉积所致的系统性疾病，受累脏器主要是周围神经和心脏[2]。Alnylam连续开发多个代际产品制霸ATTR这个患者人数众多的疾病领域。Alnylam第一代ATTR产品Patisiran就是由LNP携带小核酸去靶向降解参与生成TTR蛋白的mRNA；LNP构成决定了它主要靶向肝脏，容易引发过敏等不良反应。后来，Alnylam开发了以GalNAc为代表的偶联递送系统，增强了小核酸药物的靶向特异性，降低循环中的药物清除，但也主要用于肝脏给药，并且存在内涵体逃逸问题。
TTR人源化小鼠模型
图18.ELISA检测TTR人源化小鼠中hTTR及mTTR的表达 (n=3)
4 展望
小核酸药物相比现有小分子和抗体药物具有药物靶点筛选快、研发成功率高、不易产生耐药性、更广治疗领域和长效性等优点，并且有望从“源头”解决疾病，具有较大发展潜力。目前小核酸药物处境类似10年前的抗体药物，仍然存在部分技术难关有待突破，包括肝脏以外组织的特异性递送难题以及早期脱靶发现等问题。我国小核酸药物研究起步较晚，目前LNP和GalNAc-siRNA缀合物技术的核心专利仍然掌握在国外企业手中，国内企业需要获得相关授权或从零起步开发自主技术平台，因此需要奋起直追。
南模生物针对小核酸药物研究的常见靶点自主研发了多种人源化动物模型，助力小核酸药物的临床前研究，模型信息详见下表，欢迎咨询。
Reference：
Paunovska et al., (2022). Drug delivery systems for RNA therapeutics. Nature Reviews Genetics, https://doi.org/10.1038/s41576-021-00439-4
JACC CardioOncol . 2021 Oct 19;3(4):488-505. doi: 10.1016/j.jaccao.2021.06.006. eCollection 2021 Oct.
Lipids Health Dis . 2022 Apr 23;21(1):41. doi: 10.1186/s12944-022-01649-3.
PCSK9 Inhibition With Monoclonal Antibodies: Modern Management of Hypercholesterolemia，doi/epdf/10.1002/jcph.766
Nat Rev Dis Primers . 2018 Jun 7;4:18035. doi: 10.1038/nrdp.2018.35.
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