EMM | 4E-BP1调控伤口愈合与纤维化平衡的双重角色

上海大学医学院丁小磊团队和王娟团队在Experimental & Molecular Medicine发表研究，揭示mTORC1信号通路下游效应分子4E-BP1（4E结合蛋白1，4E-binding protein 1）在皮肤伤口愈合与纤维化重塑中的双重调控作用。研究发现，4E-BP1通过调控eIF4E介导的翻译起始，既促进创面再上皮化、血管新生与肉芽组织形成加速伤口愈合，又驱动肌成纤维细胞激活和胶原过度沉积诱发病理性纤维化。4E-BP1缺失加速伤口闭合但同时加剧博来霉素诱导的皮肤纤维化；过表达4E-BP1则延迟愈合但减轻纤维化。人类瘢痕疙瘩组织中磷酸化4E-BP1水平显著升高，单细胞转录组分析显示瘢痕组织成纤维细胞富集4E-BP1缺失与eIF4E过表达相关基因特征，提示该轴在人类病理性瘢痕形成中具有保守作用。

伤口修复中翻译调控机制尚不明确

皮肤损伤后的组织修复需经历止血、炎症、增殖与重塑等阶段，伴随广泛的代谢重编程与蛋白质合成。mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）作为营养与生长因子信号整合枢纽，在皮肤形态发生和伤口愈合中发挥关键作用。遗传敲除mTOR导致表皮屏障受损与愈合延迟，临床应用mTORC1抑制剂雷帕霉素亦损害修复反应。然而，mTORC1过度激活又促进纤维化过度增生与病理性瘢痕形成。这提示mTORC1信号需维持精确阈值以平衡修复效率与纤维化风险。

mTORC1通过磷酸化核糖体蛋白和真核翻译起始因子4E结合蛋白（4E-BPs）调控蛋白质合成。4E-BP1与eIF4E结合抑制翻译起始复合物组装，mTORC1激活后磷酸化4E-BP1使其从eIF4E释放，启动选择性mRNA翻译。糖尿病创面中4E-BP1磷酸化水平降低伴愈合能力受损，体外研究提示mTORC1/4E-BP1轴参与TGF-β1诱导的纤维化反应。然而4E-BP1在皮肤修复与纤维化中的体内功能尚未明确。

南模生物为该研究提供了Eif4ebp1敲除（Eif4ebp1−/−）小鼠模型。

磷酸化4E-BP1在伤口与纤维化组织中累积

研究团队首先检测mTORC1/4E-BP1信号在伤口修复与纤维化重塑中的激活状态。免疫荧光染色显示，全层切除性创面7天时磷酸化4E-BP1（p-4E-BP1 Thr37/46）在迁移上皮舌基底层显著累积（完整皮肤几乎检测不到），并延伸至下方肉芽组织，与经典mTORC1标志物p-S6（Ser240/244）表达模式一致。损伤后1天即可检测到p-4E-BP1与p-S6诱导，表明mTORC1信号快速响应组织损伤。博来霉素诱导的皮肤纤维化模型中，p-4E-BP1水平亦显著升高。

单细胞转录组数据分析进一步支持上述发现。正常与损伤人类皮肤样本的scRNA-seq分析显示，创面角质形成细胞与成纤维细胞中PI3K–AKT–mTORC1通路基因特征显著富集，且4E-BP1/2缺失与eIF4E过表达相关基因集上调，反映帽依赖性翻译增强。这些结果提示mTORC1/4E-BP1持续激活是生理性修复与病理性纤维化的共同特征，可能驱动组织修复与纤维化进展。

4E-BP1缺失加速伤口愈合并促进血管新生

为探究4E-BP1在伤口愈合中的功能，研究者使用4E-BP1敲除小鼠（模拟持续性mTORC1依赖性翻译激活）建立全层切除性创面模型。Eif4ebp1−/−小鼠发育正常但体重略低于野生型同窝对照。伤口愈合实验显示，4E-BP1缺失显著加速创面闭合：损伤后4天创面面积缩小至初始的约40%（对照组约70%），7天与14天时创面面积持续更小（n=7–8，p<0.01）。

组织学分析证实加速愈合表型：Eif4ebp1−/−小鼠创面上皮舌端距离缩短、肉芽组织形成显著增多、过度增殖表皮厚度增加（7天与14天时p<0.001）。Ki67染色显示，4天时基底层增殖细胞显著增多，7天时肉芽组织中亦检测到更多Ki67阳性细胞，表明4E-BP1缺失增强上皮与间质细胞增殖能力。

血管新生对伤口愈合至关重要。CD31免疫荧光染色显示，Eif4ebp1−/−创面肉芽组织血管密度显著升高（4天与7天时p<0.01），尤其在肉芽组织上层。血管内皮生长因子A（VEGF-A）是4E-BP1/eIF4E轴的翻译靶标，免疫组化与Western blot显示7天创面VEGF-A蛋白水平显著升高，但qRT-PCR显示Vegfa mRNA水平无差异，提示转录后调控。这些数据表明mTORC1/4E-BP1信号通过增强上皮来源VEGF-A翻译促进伤口血管新生。

4E-BP1缺失促进肌成纤维细胞激活与胶原纤维化

成纤维细胞感知机械张力分化为表达α-SMA的肌成纤维细胞，驱动细胞外基质（ECM）沉积与创面收缩。免疫组化显示Eif4ebp1−/−创面α-SMA阳性面积显著扩大，提示肌成纤维细胞激活增强。Western blot与免疫荧光分析证实7天创面COL1A1（I型胶原）沉积升高，表明4E-BP1缺失促进增殖期基质合成。

透射电镜（TEM）评估胶原纤维超微结构。与对照皮肤相比，Eif4ebp1−/−小鼠未损伤皮肤胶原纤维已呈现松散无序状态。损伤后7天，突变体愈合真皮胶原网络异质性增强，异常纤细纤维与肥大纤维交织，而对照组纤维组织更均一。定量分析显示纤维直径分布改变，平均直径与面积密度增加。这些发现提示4E-BP1缺失不仅促进肌成纤维细胞驱动的胶原沉积，还扰乱ECM组织结构，可能损害再生真皮的机械稳定性与功能质量。

4E-BP1过表达延迟伤口愈合并抑制胶原合成

为进一步验证4E-BP1功能，研究团队通过皮内注射腺相关病毒（AAV）载体实现4E-BP1持续过表达。Western blot确认皮肤组织4E-BP1蛋白水平显著上调。全层切除性创面实验显示，4天时两组无差异，但7天时4E-BP1过表达组创面面积显著大于对照组（AAV-GFP），提示愈合延迟。

组织学评估显示过表达组再上皮化受损，7天时上皮端距离更长、表皮覆盖不完整。免疫组化显示α-SMA表达显著降低，Western blot证实创面COL1A1水平下降。这些结果表明4E-BP1过表达负向调控关键再生过程，包括角质形成细胞增殖、血管新生、肌成纤维细胞分化与ECM产生。

4E-BP1缺失加剧博来霉素诱导的皮肤纤维化

为探究4E-BP1缺失是否在急性创面愈合之外增敏皮肤纤维化重塑，研究者采用博来霉素诱导真皮纤维化模型（模拟人类硬皮病关键病理特征）。注射后2周与4周，Eif4ebp1−/−小鼠背部皮肤纤维化病变更严重且体重下降更明显。组织学分析显示4E-BP1缺失小鼠纤维化反应显著增强，Masson三色染色证实富含胶原的ECM过度沉积。免疫染色显示α-SMA与COL1A1表达水平显著升高（p<0.01），表明胶原合成增加。

这些发现表明4E-BP1作为成纤维细胞激活与ECM沉积的分子制动器，在慢性纤维化损伤中发挥关键作用。4E-BP1缺失时，成纤维细胞对促纤维化信号反应过度，导致基质过度积累与真皮增厚。

4E-BP1过表达减轻纤维化并抑制肌成纤维细胞转化

研究进一步验证4E-BP1过表达能否保护皮肤免受纤维化。AAV介导4E-BP1过表达后每日皮内注射博来霉素4周诱导纤维化。组织学分析显示，4E-BP1过表达动物真皮厚度显著减少，Masson三色染色显示富含胶原的ECM沉积明显减少，真皮组织更松散、纤维化病灶范围更小且细胞密度更低，提示成纤维细胞激活与基质积累减弱。

免疫组化与Western blot证实4E-BP1过表达小鼠真皮α-SMA阳性肌成纤维细胞显著减少，COL1A1表达水平降低（p<0.05）。这些数据提示通过mTORC1/4E-BP1轴介导的翻译抑制限制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，并抑制纤维化ECM产生。

mTORC1/4E-BP1信号直接控制成纤维细胞胶原合成

为从机制上关联体内纤维化表型与翻译调控，研究者开展体外成纤维细胞实验。野生型与4E-BP1缺失小鼠原代真皮成纤维细胞经TGF-β1（核心促纤维化细胞因子）刺激后，下游效应分子SMAD2/3磷酸化诱导，提示TGF-β信号完整。TGF-β1刺激同时激活mTOR信号（p-4E-BP1与p-S6升高）。对照成纤维细胞中TGF-β1促进COL1A1与α-SMA表达；Eif4ebp1−/−成纤维细胞基线COL1A1蛋白水平略升高（未达统计学显著性），但TGF-β1处理后显著增强（p<0.01）。相反，4E-BP1过表达减弱TGF-β1诱导的COL1A1表达。

mTORC1抑制剂AZD8055处理有效抑制mTOR活性（p-S6与p-4E-BP1下降），高浓度时显著抑制TGF-β1诱导的COL1A1表达（p<0.05）。低浓度时Eif4ebp1−/−成纤维细胞COL1A1表达仍升高，提示4E-BP1缺失解除mRNA翻译抑制，部分绕过mTORC1阻断的抑制效应。这些体外发现直接证明4E-BP1水平控制成纤维细胞激活与胶原合成，至少部分通过解除mTORC1驱动的翻译输出实现。

人类纤维化瘢痕组织中4E-BP1介导的效应保守

为评估mTORC1信号在人类成纤维细胞纤维化反应中的作用，研究者用TGF-β1刺激原代人真皮成纤维细胞（HDFs）。免疫荧光显示4E-BP1与S6磷酸化增加，提示TGF-β1刺激诱导强mTORC1激活，伴随COL1A1表达显著升高（mRNA与蛋白水平均上调）。mTOR抑制剂AZD8055共处理有效抑制mTORC1信号（下游效应分子磷酸化降低），并显著减少COL1A1表达，表明mTORC1激活是TGF-β1诱导人成纤维细胞纤维化激活所必需的。

人类瘢痕疙瘩组织免疫染色显示p-4E-BP1水平显著升高。单细胞转录组数据分析（比较正常皮肤与病理性瘢痕包括肥厚性瘢痕与瘢痕疙瘩）显示，瘢痕相关成纤维细胞显著富集4E-BP1/4E-BP2缺失与eIF4E过表达相关基因特征（反映帽依赖性翻译增强）。这些数据提示皮肤损伤与纤维化进展后mTORC1持续激活，瘢痕微环境富集翻译相关基因特征，凸显mTORC1介导的4E-BP1抑制在调控人类皮肤伤口愈合与纤维化重塑中的关键作用。

4E-BP1作为分子变阻器平衡修复效率与纤维化风险具有转化潜力

本研究确立4E-BP1为皮肤伤口愈合与纤维化的关键调控分子，连接mTORC1信号与再生及纤维化过程的翻译控制。研究证明创面环境中mTORC1激活诱导4E-BP1磷酸化，4E-BP1基因敲除模拟完全mTORC1介导的磷酸化，加速再上皮化、增强肉芽组织形成并增加纤维化基质沉积；而4E-BP1过表达损害伤口愈合。人类瘢痕与瘢痕疙瘩组织单细胞转录组富集4E-BP1缺失或eIF4E过表达相关基因集，支持研究发现的临床相关性。mTORC1/4E-BP1/eIF4E信号轴作为调控变阻器，平衡有效组织再生与纤维化进展风险。

本研究揭示了4E-BP1在调控伤口血管新生中的作用。VEGF-A作为4E-BP1/eIF4E轴的翻译靶标，4E-BP1基因敲除（功能性模拟持续磷酸化并从eIF4E释放）导致VEGF-A蛋白水平升高与新生血管形成增强，而4E-BP1过表达抑制VEGF-A表达并减少创面血管活性。糖尿病创面中4E-BP1磷酸化与VEGF-A表达降低伴血管新生受损，支持4E-BP1介导的翻译调控与血管再生之间的功能联系。靶向4E-BP1活性可能为恢复受损愈合条件下的上皮完整性与血管功能提供策略。

ECM组成与动态重塑是创面修复、瘢痕形成与纤维化进展的关键决定因素。本研究中4E-BP1基因敲除导致胶原纤维发生紊乱（纤维直径异质性与超微结构破坏），凸显mTORC1/4E-BP1通路在创面修复期间ECM重塑中的关键作用。相反，4E-BP1过表达抑制I型胶原产生并降低α-SMA表达，导致肉芽组织形成受损与创面闭合延迟。这些发现将4E-BP1定位为mTORC1信号与ECM输出的关键效应分子。临床上肥厚性瘢痕与瘢痕疙瘩仍难以治疗，本研究观察到4E-BP1通过mTORC1依赖性磷酸化调控成纤维细胞来源的胶原合成，提示病理性纤维化与瘢痕形成中的潜在靶向机制。精细调控4E-BP1活性或丰度可能为重新平衡ECM沉积提供策略，增强再生修复同时降低纤维化结局。

研究局限与展望

尽管本研究提供了功能性见解，仍存在若干局限。4E-BP1调控成纤维细胞命运决定与胶原生物合成的下游翻译靶标尚未完全明确。虽对创面组织进行了蛋白质组学分析并观察到纤维化信号通路激活，但因实验设置的方法学限制，未能鉴定4E-BP1的直接翻译靶标。未来研究可采用核糖体足迹图谱等翻译组分析技术鉴定这些效应分子。其次，创面环境中不同细胞亚型内4E-BP1的特异性作用需进一步阐明。此外，虽然遗传学方法提供了概念验证，临床转化需开发选择性调控4E-BP1活性的药理学制剂，此类选择性调节剂可能实现创面愈合动态的精确控制，提供增强再生同时降低纤维化或瘢痕疙瘩形成风险的策略。

总之，本研究确立4E-BP1为皮肤伤口愈合与纤维化的关键调控分子，连接mTORC1信号与再生及纤维化过程的翻译控制。选择性调控4E-BP1活性可能为精细调控修复过程并限制纤维化后遗症提供有力工具。靶向泛PI3K/mTOR（4E-BP1的上游调节因子）的治疗策略已在特发性肺纤维化临床试验中探索，彰显其转化潜力。未来研究应阐明伤口愈合中4E-BP1活性的时空动态，并定义其在不同细胞区室中调控的精确翻译程序，从而挖掘该通路在临床创面管理中的治疗前景。

本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载。