交叉报告基因系统原理详解：Cre-loxP与Dre-Rox双重组酶如何实现双阳性细胞精准标记

当单一Marker无法精确定义目标细胞群时，多重组酶介导的交叉报告基因系统提供了解决方案。该系统利用Cre-loxP与Dre-Rox两套重组酶，通过交叉报告基因小鼠分别与MarkerA的Cre转基因小鼠、MarkerB的Dre转基因小鼠交配，实现对A⁺B⁺双阳性细胞的特异性标记。本文系统讲解单色与多色两种交叉报告系统的设计原理和标记逻辑，并以细支气管肺泡干细胞（BASC）为案例，展示这类报告基因工具鼠在肺干细胞谱系追踪中的应用。

目录

为什么需要多重组酶标记？

交叉报告基因系统概述

单色报告系统原理与案例

多色报告系统原理与案例

为什么需要多重组酶标记？

之前推文讲述的单重组酶报告基因系统只能依赖一个 Marker 来定位目的细胞。如果没有某种细胞类型特有的单一基因，则无法通过常规方法对其进行特异性标记。

往期推文：

【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式

【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法

但随着细胞分类的不断深入，我们往往需要两个甚至两个以上的 Marker 才能准确定位想要研究的细胞群体。在一个细胞群中靶向两个基因启动子，可能比依赖传统报告系统中常用的单个启动子更精确。这时标记细胞就需要使用到多重组酶介导的遗传方法。

控制由两个启动子驱动的受限制报告基因表达，需要两种不同的重组酶系统，例如 Cre-loxP、Flp-frt、Dre-rox 和 Nigri-nox 等。目前已经开发了多种双重组酶介导的遗传标记系统，以增强特异性和同时标记的细胞类型数量。常见的可分为交叉报告基因类型、独家报告基因类型和嵌套报告基因类型。这些遗传修饰动物模型为精准谱系示踪提供了丰富的工具选择。

图1. 多重组酶介导的基因重组系统 [1]

本期鼠博士为大家讲解多重组酶介导的交叉报告基因类型。

交叉报告基因系统：解决"双阳性"标记问题

为了精确标记一个细胞群，有时需要使用两个细胞特异性 Marker 来定义细胞群——例如 MarkerA 与 MarkerB 双阳性的细胞（A⁺B⁺ Cell）。如何使用合适的报告基因标记系统，特异性标记这类细胞呢？

这时就需要用到交叉报告基因系统——一类专为标记双阳性细胞设计的报告基因工具鼠。

交叉报告基因系统用于标记两个 Marker 双阳性的细胞类型，根据标记颜色也可分为单色报告系统与多色报告系统。

单色报告系统

交叉报告基因小鼠与细胞特异性 MarkerA 的 Cre 转基因小鼠、细胞特异性 MarkerB 的 Dre 转基因小鼠进行交配。得到的小鼠体内，两个 Marker 双阳性的细胞被标记为单色，其他细胞不被标记上颜色。

图2. 单色报告系统

四种细胞类型的标记结果：

· A⁻B⁻ 细胞： 系统遇到 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

· A⁺B⁻ 细胞： MarkerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 Stop 序列被切除）。之后遇到第二个 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

· A⁻B⁺ 细胞： MarkerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶切除两个 Rox 位点之间的序列（第二个 Stop 序列被切除）。之后遇到第一个 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

· A⁺B⁺ 细胞： MarkerA 介导 Cre 酶切除第一个 Stop，MarkerB 介导 Dre 酶切除第二个 Stop。两个 Stop 序列均被移除后，系统表达红色荧光 tdTomato。

结果：仅 A⁺B⁺ 细胞被标记为红色。

案例 1：特异性标记细支气管肺泡干细胞（BASC）

BASC 是位于细支气管肺泡管交界处的多能干细胞，它们共同表达细支气管细胞标志物 Scgb1a1（也称为 CC10）和肺泡2型细胞标志物 Sftpc。由于缺乏专门定义 BASCs 的单一标记基因，无法使用传统的 Cre-loxP 介导的谱系追踪方法追踪 BASCs 的分化命运。而通过双标志物就可以特异性地追踪 Scgb1a1⁺Sftpc⁺ BASC。这是交叉报告基因工具鼠在肺干细胞研究中的典型应用。

图3. 单色交叉报告基因系统 [1]

多色报告系统

为了通过使用其他颜色同时对多种细胞类型（细胞群及其亚群）进行遗传标记，交叉遗传报告基因系统会结合两个或多个报告基因。

交叉报告基因小鼠与细胞特异性 MarkerA 的 Cre 转基因小鼠、细胞特异性 MarkerB 的 Dre 转基因小鼠进行交配。得到的小鼠体内，A⁺B⁻ 单阳性细胞、A⁻B⁺ 单阳性细胞、A⁺B⁺ 双阳性细胞被标记为三种不同的颜色，其他细胞不被标记上颜色。

图4. 多色报告系统

四种细胞类型的标记结果：

· A⁻B⁻ 细胞： 系统遇到 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

· A⁺B⁻ 细胞： MarkerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 Stop 序列被切除）。之后系统按照第一个启动子方向，表达红色荧光 tdTomato。

· A⁻B⁺ 细胞： MarkerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶切除两个 Rox 位点之间的序列（第二个 Stop 序列被切除）。之后系统按照第二个启动子方向，表达绿色荧光 ZsGreen。

· A⁺B⁺ 细胞： MarkerA 介导 Cre 酶切除第一个 Stop，MarkerB 介导 Dre 酶切除第二个 Stop。两个 Stop 序列均被移除后，系统同时表达红色荧光 tdTomato 与绿色荧光 ZsGreen，两个蛋白的颜色重叠后呈现黄色荧光。

结果：A⁺B⁻ 细胞标记为红色；A⁻B⁺ 细胞标记为绿色；A⁺B⁺ 细胞标记为黄色。

案例 2：多色标记区分 BASC 及其相关细胞群

细支气管细胞标志物 Scgb1a1 阳性的细胞会被标记为红色，肺泡2型细胞标志物 Sftpc 阳性的细胞会被标记为绿色，而双阳性的细支气管肺泡干细胞（BASC）由于同时表达红色与绿色荧光而被标记为黄色。这样可以通过不同的颜色准确区分不同来源的细胞，增强对细胞群命运可塑性的理解。

图5. 多色交叉报告基因系统 [1]

Reference：

[1] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424.

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