谱系示踪中基因标记异位表达的解决方案：独家报告基因系统原理与案例详解

谱系示踪中，启动子在非目标细胞中的弱激活（异位表达）是导致细胞命运追踪争议的常见原因。独家报告基因系统（Exclusive Reporter）利用Cre-loxP与Dre-Rox双重组酶的错落排布，使首次重组自动阻断二次重组，从而实现A⁺B⁻细胞的精准标记，排除异位表达干扰。本文详解独家报告基因系统的结构设计、两种重组先后顺序下的标记逻辑，以及c-kit基因在心脏谱系追踪中的经典应用案例，为选择合适的报告基因工具鼠提供参考。

目录

异位表达为什么是谱系示踪的难点？

独家报告基因系统的结构与原理

情况一：A-Cre先表达

情况二：B-Dre先表达

如何避免异位表达？

案例：c-kit基因的异位表达问题

异位表达为什么是谱系示踪的难点？

做谱系示踪的小伙伴们，有没有遇到过这样的困扰：明明选了一个"特异性"很好的标记基因，结果追踪下来发现标记到的细胞"不太对"？

问题很可能出在异位表达上。通常，细胞类型中基因的激活不是"有"或"无"，特定的基因标记意味着启动子的活性在这种细胞类型中相对较高，而在其他细胞中，目的启动子也可能被弱激活——这种现象就是异位表达。异位表达对谱系追踪的影响很大，常常会导致一些关于细胞命运的争议。

图1. 异位表达对谱系示踪的影响 [1]

本期鼠博士来讲述可以用于避免基因标记异位表达的独家报告基因系统——一类专为解决异位表达问题而设计的报告基因工具鼠。

独家报告基因系统的结构是：

Promoter - site1 - site2 - Stop - site1 - reporter A - Stop - site2 - reporter B

这类系统利用两个重组系统，将两对识别位点错落地分布在两个报告基因两端。核心逻辑：如果首先发生一个重组，则相应报告基因的表达将去除另一个重组系统的一个识别位点——也就是说，这个系统会防止同一细胞中发生二次重组。

独家报告基因小鼠的基因重组存在先后顺序，可能出现以下两种情况：

情况一：A-Cre 先表达，B-DreERT2 后续通过 Tamoxifen 诱导表达

图2. A-Cre 先表达，B-DreERT2 后续通过 Tamoxifen 诱导表达

当 A-Cre 先表达时：

· A⁺ 细胞： MarkerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 Stop 序列与第一个 Rox 位点被切除）。该系统表达绿色荧光 ZsGreen。

· A⁻ 细胞： 系统未发生重组，遇到第一个 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 诱导 B-DreERT2 时：

· A⁺ 细胞： 由于第一个 Rox 位点已被切除，无论细胞是否表达 MarkerB，该系统均只表达绿色荧光 ZsGreen。

· A⁻B⁺ 细胞： MarkerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶切除两个 Rox 位点之间的序列（ZsGreen、第二个 loxP 位点与第二个 Stop 序列被切除），之后表达红色荧光 tdTomato。

· A⁻B⁻ 细胞： 遇到 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

结果：A⁺ 细胞标记为绿色。A⁻B⁺ 细胞标记为红色。

情况二：B-Dre 先表达，A-CreERT2 后续通过 Tamoxifen 诱导表达

图3. B-Dre 先表达，A-CreERT2 后续通过 Tamoxifen 诱导表达

当 B-Dre 先表达时：

· B⁺ 细胞： MarkerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶切除两个 Rox 位点之间的序列（ZsGreen、第二个 loxP 位点与第二个 Stop 序列被切除）。该系统表达红色荧光 tdTomato。

· B⁻ 细胞： 系统未发生重组，遇到第一个 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

之后，使用 Tamoxifen 诱导 A-CreERT2 时：

· B⁺ 细胞： 由于第二个 loxP 位点已被切除，无论细胞是否表达 MarkerA，该系统均只表达红色荧光 tdTomato。

· A⁺B⁻ 细胞： MarkerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 Stop 序列与第一个 Rox 位点被切除），之后表达绿色荧光 ZsGreen。

· A⁻B⁻ 细胞： 遇到 Stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

结果：B⁺ 细胞标记为红色。A⁺B⁻ 细胞标记为绿色。

独家报告基因系统如何避免异位表达？

独家报告基因小鼠可帮助您标记 A⁺B⁻（反之亦然）的细胞类型。因此，若我们想标记 MarkerA 的细胞，但 A 基因出现了异位表达，那我们可以利用在非目的细胞中特异性表达的 MarkerB，使用独家报告基因系统将其标记为其他颜色，从而排除 MarkerA 异位表达的影响。

这正是这类报告基因工具鼠在谱系示踪中的独特价值——通过"排除法"实现精准标记。对于需要高精度谱系追踪的转基因小鼠实验方案设计，独家报告基因系统提供了一种可靠的解决思路。

案例：c-kit 基因的异位表达问题

以 c-kit 基因为例。既往研究报道 c-kit⁺ 细胞是心肌细胞祖细胞（ECs），可能有助于心脏损伤后的新心肌细胞生成。然而，随后的研究表明，c-kit 基因也在极少数心肌细胞中表达，表明心脏损伤后追踪到的心肌细胞可能是先前标记的 c-kit⁺ 心肌细胞。

核心问题： 我们需要特异性靶向 c-kit⁺ 非心肌细胞，追踪其分化命运，才能得出正确的结论。

解决方案： 使用心肌细胞特异性标记工具 Tnni3-Dre 将心肌细胞进行标记（红色），之后再对 c-kit⁺ 细胞进行标记（绿色），此时标记的绿色细胞即为 c-kit⁺ 非心肌细胞。

图4. 独家报告基因系统 [2]

图5. 使用普通方法标记 c-kit⁺ 细胞无法准确标记 ECs [2]

使用建议

上述讲述的是多重组酶报告基因系统的独家报告基因类型，主要用于标记 A⁺B⁻（反之亦然）的细胞类型。这种标记存在先后顺序，相反的先后顺序会极大影响后续的标记结果。建议两个重组酶中一种采用可诱导类型的重组酶，从而合理控制重组发生的先后顺序。

但如果您想标记的细胞类型，在胚胎发育期 MarkerA 表达，但在成年后 MarkerA 不表达并且表达 MarkerB——若采用独家报告基因系统使用 A-Cre 与 B-DreERT2，目的细胞仍无法成功标记。

是否存在可以使用两个重组酶均是可诱导型的（可控制重组发生的时间），两者之间的重组不会相互干扰，而且还可以成功标记 A⁺B⁻ 的细胞类型的转基因小鼠工具呢？

Reference：

[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, Cai D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424.

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