转基因小鼠谱系示踪：Cre-loxP与KI/TG细胞标记方式全解析
谱系示踪（lineage tracing）是通过遗传标记追踪特定祖细胞分化命运的核心技术，广泛应用于发育生物学、组织再生和疾病研究。本文系统介绍两类基础细胞标记策略：基于KI/TG的直接标记（随机转基因、融合表达、共表达、取代表达四种构建方式）和基于Cre-loxP重组酶系统的永久遗传标记（含组成型Cre和诱导型CreERT2），解析转基因小鼠及报告基因工具鼠在谱系示踪中的应用原理与选择逻辑，为工具小鼠的选型提供参考。
本文目录
01 基于KI/TG策略的细胞标记
02 基于基因重组酶系统策略的细胞标记
想搞清楚某类祖细胞最终变成了什么？它的后代分布在哪些组织里？谱系示踪（lineage tracing）就是为此而生的技术——通过对特定细胞亚群进行遗传标记，在后续时间点追踪其分化命运。建立能够在体内追踪细胞谱系的动物模型，一直是发育生物学和再生医学研究的核心目标。
本期，鼠博士就带大家从头梳理谱系示踪中常用的两种类型：KI/TG策略（直接标记当前表达的细胞）和基因重组酶系统策略（永久标记细胞及其所有后代）。
01 基于KI/TG策略的细胞标记
自1990年代初以来，基因修饰技术一直用于细胞谱系追踪，是大多数谱系示踪研究的首选方法。基于KI/TG策略，是使用转基因（Tg）或基因敲入（KI）的方式，将报告基因整合进目的基因（常为目的细胞marker或细胞特异性表达的启动子），实现针对特定细胞的标记。
这种细胞标记的构建分为以下几种类型：
类型一：随机转基因
将含有报告基因的外源DNA片段克隆至PiggyBac（PB）转座子质粒中，与转座酶一起注射到小鼠受精卵中。在转座酶作用下，外源DNA片段被整合到基因组上的TTAA位点处，从而获得表达报告基因的转基因小鼠。
类型二：基因敲入——融合表达
将报告基因敲入到小鼠内源基因的5'端或3'端，与内源基因融合表达。
类型三：基因敲入——共表达
将报告基因通过2A（自剪切多肽）或IRES（内部核糖体进入位点序列）元件敲入到小鼠内源基因的3'端。
类型四：基因敲入——取代表达
将报告基因敲入到小鼠内源基因的5'端，并取代小鼠本身的基因，使敲除和敲入同时发生。
KI/TG策略的标记特点
通过KI/TG策略标记的细胞，仅可标记当前正在表达目的基因的细胞。曾经表达目的基因但现在不表达的细胞，与现在正在表达但分化后不表达目的基因的后代细胞，均不会被报告基因标记。
适用场景： 基因表达监测、细胞定位等无需关注目的细胞后代的研究。
02 基于基因重组酶系统策略的细胞标记
基因位点特异性重组酶系统通过特异位点重组酶（site-specific recombinases, SSRs）介导重组酶特异识别位点（recombination target sites, RTs）间的重组，来实现特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位等操作。
基于该系统的细胞标记技术被广泛应用于器官发育、组织再生和疾病研究。目前多种重组酶系统被普遍使用，例如Cre-loxP、Flp-frt和Dre-rox系统，其中使用最普遍的为Cre-loxP系统。这类工具小鼠（如Cre工具鼠和报告基因工具鼠）是谱系示踪实验的基础。
Cre-loxP系统
借助重组酶系统构建条件性表达报告基因的小鼠模型需要使用到至少两种类型的小鼠：
· Flox报告鼠： 将携带报告基因的DNA序列插入到小鼠Rosa26位点上，并在启动子和报告基因之间插入转录终止盒（loxP-stop-loxP）
· 特异性Cre鼠： 由特定启动子驱动或连接在特定细胞marker之后，可在特定细胞或组织表达Cre重组酶
将上述两种小鼠交配后，子代中可获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠。该小鼠在表达Cre重组酶的细胞或组织中，终止盒被Cre重组酶切除，仅在这些细胞或组织中表达报告基因。
关键特性： 由于Cre/loxP系统介导的删除是不可逆的，转录终止盒被去除后，细胞会稳定表达报告基因。当重组发生后，即使被标记细胞的后代不表达Cre，这些后代细胞同样会被报告基因标记。
即：Cre策略标记的细胞来源于曾经或者正在表达Marker基因（表达Cre）的细胞。
CreERT2-loxP系统（诱导型）
为实现重组的时间与空间双重控制，进一步开发了CreERT2-loxP系统，可使用他莫昔芬进行诱导重组，从时间上调控Cre-loxP重组。这种方法也被称为诱导型Cre重组酶系统。
原理： 雌激素受体（ER）在没有配体时与胞质中的热休克蛋白90（HSP90）结合，无法进入细胞核。CreERT2将雌激素受体的配体结合域和Cre酶共表达——当给予他莫昔芬后，CreERT2与HSP90解离，进入细胞核执行重组功能。
标记特点： 基于CreERT2系统的细胞标记依赖于他莫昔芬诱导。当他莫昔芬存在时，转录终止盒被去除，细胞开始表达报告基因；当他莫昔芬代谢完后，基因重组不会再进行。
即：CreERT2策略标记的细胞来源于他莫昔芬代谢期中表达Marker基因（表达CreERT2）的细胞与这些细胞的后代。 在他莫昔芬代谢结束后，即使表达Marker基因（表达CreERT2）的细胞也不会被报告基因标记。
总结
除了上述基础标记方式外，根据重组类型和数量，基因重组系统还可分为更复杂的单重组酶介导的多色报告系统方法和多重组酶介导的遗传方法。
南模生物拥有丰富的报告基因工具鼠和Cre工具小鼠资源库，可为谱系示踪研究提供从模型构建到繁育的全流程支持。若您有相关需求，欢迎拨打400-728-0660热线或于微信公众号南模生物SMOC在线咨询，我们的专业团队将竭诚为您服务！
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参考文献：
Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020;295(19):6413-6424. doi:10.1074/jbc.REV120.011631
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