基因敲除小鼠WB还有条带？三个原因帮你逐一排查

基因敲除小鼠（Knockout mice）是研究基因功能的核心工具，但不少研究者在WB验证时发现：纯合子敲除后目标蛋白条带仍然存在。本文从CRISPR/Cas9构建原理出发，系统解析敲除后仍检测到蛋白的三大常见原因——抗体特异性不足、截断蛋白残留、多转录本未完全覆盖，并提供对应的排查策略，帮助使用基因修饰模型的研究者高效定位问题、优化遗传修饰动物模型的表型验证流程。

01 什么是基因敲除？

02 如何验证KO结果？

03 为什么纯合子敲除鼠仍能检测到蛋白？

明明测序结果显示基因已经成功敲除了，Western blot一跑——目标蛋白的条带居然还在？相信不少做过KO实验的小伙伴都碰到过这个让人抓头的情况。别慌，这不一定是你的小鼠有问题，原因可能比你想象的更多元。

本期，小编就带大家拆解一下：基因敲除的基本原理是什么？KO结果该怎么验证？以及纯合子敲除后仍检测到蛋白条带，到底可能是哪几种情况。

01 基因敲除小鼠（Knockout）

目前实现基因敲除的方式主要有两种：

· 同源重组方式 — 通过构建打靶载体，利用同源重组替换或中断目标基因

· CRISPR/Cas9技术 — 在关键外显子两端设计gRNA，由Cas9蛋白对靶点进行切割，导致关键外显子缺失或移码突变，实现基因敲除

CRISPR/Cas9的工作原理

具体来说，CRISPR/Cas9实现基因敲除的过程如下：

· 识别靶点： 设计与目标基因序列互补的导向RNA（sgRNA），引导Cas9蛋白识别并结合到特定DNA序列上

· 切割DNA： Cas9蛋白对DNA进行切割，形成DNA双链断裂（DSB）

· 错误修复： 细胞通常采用非同源末端连接（NHEJ）方式修复断裂DNA，修复过程中会发生碱基插入或缺失，造成移码突变（图1）

移码突变的后果： 后续编码的氨基酸序列发生改变，导致基因编码的蛋白质失去正常功能；如果插入或缺失的碱基数量较多，还可能导致关键外显子直接缺失。

图1. 基于CRISPR/Cas

对KO小鼠来说，验证敲除结果是必要的一步，主要从两个层面进行：

· DNA水平验证： 通过测序确认目的序列是否已被敲除

· 蛋白水平验证： 通过免疫印迹分析（Western blotting，WB）检测目标蛋白是否消失

03 为什么纯合子敲除鼠仍能检测到蛋白？

敲除后蛋白没有完全消失的现象其实比较常见。小编总结了以下几种可能原因：

原因一：抗体特异性不足

非特异性条带是蛋白检测中最常见的问题。使用高质量、特异性强的抗体是获得可靠结果的关键。

如果抗体特异性不好，非特异性蛋白会干扰实验结果。针对这一问题，可结合PCR检测敲除基因mRNA的表达情况——当未检测到敲除基因mRNA表达时，需要考虑更换其他品牌的抗体重新检测目的蛋白。

小编有话说：关于抗体特异性验证

Abcam和LI-COR联合在《生物化学杂志》（JBC）上发表了题为"Antibody Validation for Western blot: By the User, for the User"的论文，就抗体验证标准提出了最佳实践建议。

目前接受度最广且最受信任的抗体特异性验证方法是基因敲除（KO）验证。 作为衡量抗体特异性的金标准，KO验证中以敲除样本作为真正的阴性对照，验证抗体是否能特异性识别目标蛋白。与野生型相比，KO中的信号丢失是特异性的可靠证据。

所以大家在选择抗体时，一定要注意该抗体是否进行过KO验证。

原因二：抗体结合位点问题（截断蛋白残留）

移码突变型的敲除可以表达出目的基因N端的部分肽段，从而产生截断蛋白的残留。如果所使用的抗体结合位点恰好位于该残留蛋白上，抗体就会与残留蛋白结合，进而检测到条带。

解决方案： 选择抗体时尽可能选择识别C端肽段的抗体，避开可能残留的N端截断蛋白。

原因三：基因多转录本

一个基因通常含有多个不同的转录本。通过NCBI、Ensembl或UCSC等数据库可查看目标基因的全部转录本信息。

排查思路：

· 核对敲除方案是否完全覆盖了所有转录本

· 如果有未覆盖的转录本，其产物与WB条带分子量是否能对应上

在构建基因修饰模型时，充分了解目标基因的转录本结构，是避免此类问题的前提。

对于基因敲除后仍存在蛋白表达的情况，原因往往比较复杂。大家在实验中如果遇到这种问题，一定要和技术专家充分沟通，逐一排查可能的原因。

小编在此祝大家实验顺利，结果多多！

关于我们

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。

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参考文献：

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