CRBN人源化小鼠模型：分子胶与PROTAC体内药效验证的关键工具

靶向蛋白降解技术（TPD）通过泛素-蛋白酶体途径实现"不可成药"靶点的突破，其中分子胶与PROTAC是两大主流策略，而CRBN（Cereblon）是被研究最广泛的E3连接酶靶点。本文系统介绍TPD原理、分子胶与PROTAC的作用机制、CRBN靶点药物研发现状，并展示南模生物自主开发的人源化小鼠模型hCRBN（NM-HU-225071）的RT-PCR、WB、体内PK及药效学验证数据，为基于遗传修饰动物模型的临床前CRO药物评价提供参考。

01 靶向蛋白降解技术

02 分子胶

03 PROTAC

04 为什么CRBN这么"香"？

05 南模生物CRBN靶点人源化小鼠

做药物研发的小伙伴们一定对这个困境不陌生：明明找到了跟疾病密切相关的蛋白靶点，却因为缺少"可成药口袋"而束手无策——传统小分子抑制剂根本没处下手。靶向蛋白降解技术（TPD）的出现，让这些"不可成药"的靶点有了被攻克的可能。而在TPD的两大主流策略——分子胶和PROTAC中，**CRBN（Cereblon）**是被研究得最广泛的E3连接酶靶点。

本期，小编就带大家系统梳理一下：靶向蛋白降解的基本原理是什么？分子胶和PROTAC各自怎么工作？CRBN为什么这么"香"？以及南模生物的CRBN人源化小鼠能为药物研发提供哪些支持。

01 靶向蛋白降解技术

在药物研发领域，靶向蛋白降解（targeted protein degradation，TPD）技术正在显著拓展可靶向的疾病机制和适应症范围。该技术能够针对传统小分子抑制剂或抗体药物难以触及的蛋白靶点发挥效力，使那些曾被认定为"不可成药"的靶点变得可及。

靶向蛋白降解剂是一类能够促使特定蛋白质在细胞内被降解的药物或化合物，这种降解通常通过细胞自身的泛素-蛋白酶体途径实现。

知识小课堂：泛素-蛋白酶体系统（UPS）

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）是真核细胞内主要的蛋白质降解途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解。UPS由以下组分构成：

· 泛素（ubiquitin, Ub）

· 泛素活化酶（E1）

· 泛素结合酶（E2）

· 泛素连接酶（E3）

· 蛋白酶体及其底物（蛋白质）

UPS通过多个连续反应降解靶蛋白：在ATP依赖的第一步中，E1结合并激活泛素；而后泛素被转移到E2上，形成E2-泛素中间体；E3连接酶结合中间蛋白和底物蛋白，催化泛素和底物蛋白之间形成异肽键，完成底物蛋白的泛素化和多聚泛素化；泛素化的蛋白质被蛋白酶体识别并结合，在蛋白酶催化下分解为短肽或氨基酸。

图1. 泛素蛋白酶体系统的示意图 [1]

在靶向蛋白降解剂中，PROTAC（proteolysis targeting chimeras）和分子胶（Molecular Glue）是备受关注的两大策略。

02 分子胶

分子胶（Molecular Glue）并非双功能分子，它通常是一种结合在E3连接酶上的小分子化合物。它们通过改变E3连接酶的表面结构，使其能够与原本不结合的蛋白质发生相互作用，进而促进目标蛋白的降解。

简单来说：分子胶像一块"双面胶"，贴在E3连接酶表面，让它"粘"住原本粘不住的靶蛋白，然后送去降解。

图2. 分子胶结构及其作用机制 [2]

03 PROTAC

PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）的本质是一种双功能分子，通过连接靶蛋白和E3连接酶，诱导靶蛋白泛素化降解。其结构可以拆解为三部分：

· 一端：靶蛋白结合域 — 与需要降解的致病蛋白特异性结合

· 另一端：E3连接酶招募域 — 募集E3连接酶

· 中间：连接子（Linker） — 连接两端

PROTAC通过搭建"靶蛋白-PROTAC-E3连接酶"三元复合物，促使泛素分子标记靶蛋白，由蛋白酶体将其降解。

图3. PROTACs的作用原理 [3]

04 为什么CRBN这么"香"？

Cereblon（CRBN）是蛋白质降解研究中被研究得最广泛的E3连接酶靶点。 作为Cullin 4 RING E3泛素连接酶（CRL4）的底物识别受体，CRBN与DDB1、Cullin 4（CUL4A或CUL4B）和Ring-Box 1（RBX1）共同形成CRL4^CRBN复合物。

目前PROTACs和分子胶主要使用的CRBN配体仍然是免疫调节抑制剂（IMiDs），包括：

· 来那度胺（Lenalidomide）

· 沙利度胺（Thalidomide）

· 泊马度胺（Pomalidomide）

但这些化合物存在一定缺陷，如易消旋和易降解neosubstrate等，因此研究人员一直在开发新型CRBN配体。

05 南模生物CRBN靶点人源化小鼠

做CRBN相关药物开发，一个绑不开的难题是：人和小鼠CRBN蛋白虽然高度同源（94%），但V388和E377氨基酸残基的人鼠差异足以破坏沙利度胺在小鼠体内的抗肿瘤疗效和致畸毒性。 这意味着，用普通小鼠做体内药效验证，很可能得到假阴性结果。

缺乏合适的人源化小鼠模型，严重限制了CRBN靶向蛋白降解剂的基础研究和新疗法研发。

南模生物长期致力于药物靶点人源化研究领域，自主开发了人源化CRBN敲入小鼠模型（hCRBN，目录号：NM-HU-225071），该模型在靶细胞中表达全长人CRBN蛋白，为评估CRBN靶向蛋白降解剂的体内疗效和毒性提供了有力工具，可广泛应用于临床前CRO药物评价研究。

RT-PCR检测人CRBN表达

图4. Detection of CRBN expression in spleen, brain, liver, intestine and muscle tissues by RT-PCR.

Wild type: only one band at 185 bp with primers F1/R1 (mCrbn);

Homozygous: one band at 262 bp with primers F2/R2 (hCRBN) and one band at 374 bp with primers F3/R3 (hCRBN);

Abbr. M, DNA marker; HO, homozygous; WT, wild type.

WB检测人CRBN表达

图5. Expression characterization of hCRBN in homozygous hCRBN KI mice by Western blot.

WB检测GSPT1、CK1α和Myc表达

CC-885是一种CRBN调节剂，在多种肿瘤细胞中具有抗增殖活性。CC-885可以诱导IKZF1降解，还可以促进CRBN与新型底物GSPT1的结合，靶向其降解。

图6. The degradation of GSPT1, CK1a and Myc by Lenalidomide and CC-885 in hCRBN knockin mice were determined by western blot.

The splenocytes derived from wild-type C57BL/6 (WT) and homozygous hCRBN KI (HO) mice were treated with 1% DMSO, Lenalidomide (10 nM, 100 nM, 1000 nM) and CC-885 (10 nM, 100 nM, 1000 nM), respectively, in RPMI-1640 cell culture medium for 18 hours ex vivo.

In vivo PK analysis

图7. Blood concentration curves of Lenalidomidein in C57BL/6 and HO hCRBN mice (female, 10wks, n=3).（In cooperation with a client）

图8. Blood concentration of CC-885 in C57BL/6 and hCRBN mice 1h after first administration (female, 10wks). (In cooperation with a client）

In vivo efficacy study

图8. Mean body weight (A) and survival curve (B) of C57BL/6 and HO hCRBN KI mice treated with CC-885 or vehicle (n=8/group).

All hCRBN mice treated with CC-885 dead within 2 days, while mice from other groups survived. The result indicates that CC-885 exhibits significant toxicity only in hCRBN humanized mice (In cooperation with a client).

图9. The degradation of GSPT1, CK1a and Myc by CC-885 in C57BL/6 and hom hCRBN knockin mice in vivo (In cooperation with a client).

The wild-type C57BL/6 (WT, group 1&2) and homozygous hCRBN KI (HO, group 3&4) mice were treated with vehicle (group 1&3) and 5 mg/kg CC-885 (group 2&4), respectively. The mice were anesthetized, perfused, and tissues were harvested at 6 hr post the 2nd administration.

南模生物作为遗传修饰动物模型领域的科创板上市公司，已建立覆盖模型构建、饲养繁育、表型分析和药物临床前评价的全链条技术平台，可为CRBN及其他靶点的蛋白降解剂研发提供从人源化小鼠模型到体内药效评估的一站式服务。

关于我们

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。

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参考文献：

Yamamoto J, Ito T, Yamaguchi Y, Handa H. Discovery of CRBN as a target of thalidomide: a breakthrough for progress in the development of protein degraders. Chem Soc Rev. 2022;51(15):6234-6250. doi:10.1039/d2cs00116k

Weagel, E.G., Foulks, J.M., Siddiqui, A. et al. Molecular glues: enhanced protein-protein interactions and cell proteome editing. Med Chem Res 31, 1068–1087 (2022). https://doi.org/10.1007/s00044-022-02882-2

Thapa R, Bhat AA, Gupta G, et al. CRBN-PROTACs in Cancer Therapy: From Mechanistic Insights to Clinical Applications. Chem Biol Drug Des. 2024;104(5):e70009. doi:10.1111/cbdd.70009