Cre-LoxP系统种系重组（Germline Recombination）：条件性敲除小鼠实验的关键陷阱与检测策略

Cre-LoxP系统是构建条件性敲除小鼠（Conditional Knockout）的核心工具，但种系重组（Germline Recombination）会导致Cre阴性对照组也发生全身性重组，影响实验结论。种系重组源于Cre重组酶在生殖细胞（卵巢/睾丸)中表达。本文介绍种系重组机制、基因型鉴定策略（Flox/KO/KI等位基因检测），并提供Find CRE工具鼠数据库、报告基因工具鼠等南模生物基因修饰模型资源。

目录

Cre-LoxP系统基本原理与非预期重组

种系重组的概念与发生机制——案例解析

种系重组的检测策略——条件性敲除小鼠基因型鉴定方法

南模生物Cre工具小鼠与基因修饰模型资源

大家好，这里是小编。

用Cre-LoxP系统做条件性敲除实验的小伙伴，可能都经历过这样的困惑：明明设计的是组织特异性敲除，结果却在Cre阴性的对照组小鼠中也检测到了重组信号；或者发现报告基因的表达范围远超预期，出现了"非特异性表达"。

遇到这种情况，很可能是你的Cre工具小鼠发生了种系重组（Germline Recombination）。

种系重组是Cre-LoxP系统应用中的一个常见陷阱——Cre重组酶在生殖细胞（卵巢或睾丸）中表达，导致Floxed序列在配子形成阶段就已经重组，这样产生的子代即使不携带Cre基因，体内也已经发生了全身性的重组。

本期，小编就给大家系统讲解一下种系重组的概念、如何检测，以及如何避免它对实验结果的影响。

1. Cre-LoxP系统基本原理

Cre小鼠因其广泛的应用而备受青睐。依据Cre-LoxP系统的原理，当Cre工具小鼠与携带Floxed序列的各类小鼠（包括但不限于条件性敲除小鼠，泛指所有含有loxP位点的基因修饰模型）进行交配后,子代小鼠中表达Cre酶的组织细胞将经历特定的基因重组，使Floxed序列实现敲除或反转等改变。

图1.  The schematic below shows the three types of rearrangements: inversion, deletion and translocation.

Fig 1. The schematic below shows the three types of rearrangements: inversion, deletion and translocation.

很多科研工作者希望使用Cre小鼠在特定组织细胞中提供的Cre重组酶来实现课题设计中预期的特异性重组。但是，在实际应用过程中，许多研究者都发现，Cre小鼠的Cre酶不像预期中一样"可控"——在部分Cre小鼠的配繁过程中，可能会检测到一些"非预期的重组"。

遇到这种情况时，研究者需要考虑，小鼠是否发生了生殖系重组，即种系重组。

2. 什么是种系重组？

在具体介绍种系重组的概念之前，我们先来看一个案例。

图2.  Nonspecific Expression of a Reporter Gene from a Genetic Cross of Oprk1 Cre/wt

Fig 2. Nonspecific Expression of a Reporter Gene from a Genetic Cross of Oprk1 Cre/wt; Rosa26 lox-stop-lox-tdTomato/wt with a Wild-Type Mouse [1].

· 实验设计

上图中的两只小鼠来自相同的亲本小鼠：

子一代：使用Cre品系（GeneX Cre/wt）与有LSL结构的报告基因工具鼠（Reporter Lox/wt）杂交，得到雌雄双杂子代（GeneX Cre/wt；Reporter Lox/wt）

子二代：使用雌雄双杂小鼠分别与雄雌野生型小鼠杂交

· 意外观察

左侧小鼠：基因型鉴定时发现其没有Cre基因表达，但外观可见明显红色荧光表达

右侧小鼠（左侧小鼠的同窝对照）：基因型鉴定发现其为正常的双杂子代小鼠

通过进一步的脑组织切片观察荧光表达发现，左侧小鼠脑组织中有广泛的红色荧光，且在不同细胞中（在血管处）观察到了非特异红色荧光表达；而右侧小鼠则仅观察到目的细胞特异的红色荧光表达。

很明显左边的小鼠发生了"非预期重组"，也就是我们前面提到的种系重组。

· 种系重组的发生机制

种系重组一般发生在亲本小鼠（无论雌雄）基因组中同时有Cre基因和Floxed序列表达的时候。之所以会发生种系重组，是因为在某些Cre小鼠中，Cre重组酶会在其生殖系细胞中表达（如睾丸、卵巢），而Cre酶介导的重组可能发生在配子发生的二倍体阶段。

这种情况下产生的单倍体子细胞形成的胚胎发育得到的子二代小鼠，即使没有Cre酶基因的表达，依然可能观察到报告基因的表达。

3. 种系重组的检测

种系重组的发生会导致我们预期只在特定类型细胞中的重组广泛发生在子代小鼠体内。若我们未能及时检测发现这些问题，可能导致课题研究从根本上存在漏洞（毕竟若发生了种系重组，Cre阴性的小鼠也可能已发生了广泛重组，而Cre阴性的小鼠在很多课题中被用作对照组）。

条件性敲除小鼠（CKO）及条件性敲入小鼠（CKI）中的检测

对于Floxed品系来说，基因型鉴定的常规引物一般设计在其loxP位点的上下游（即下图B、C中a、b引物），以确认其loxP位点是否已发生预期插入。这种鉴定对于Floxed品系小鼠单品系繁育是足够的，但若与Cre品系小鼠配繁后使用，仅使用这一组引物进行基因型鉴定，可能会"误检"部分子代小鼠的基因型。

如下图B中第二泳道中样本为+/+（野生型），而第六泳道中样本则为+/-（由于发生了种系重组，导致该小鼠一半染色体上的Floxed序列已经发生了重组，即敲除，无法被检测到；而另一半染色体上无loxP位点插入）。这两种基因型的小鼠在目的基因的表达上有很大差异，但若仅通过a、b引物来进行基因型鉴定，会导致很大的误差。

图3.  Breeding and Genotyping Strategies for Conditional KO/KI Mice [2].

Fig 3. Breeding and Genotyping Strategies for Conditional KO/KI Mice [2].

· 推荐的鉴定策略

使用Floxed品系与Cre小鼠配繁后，在进行常规的loxP位点插入鉴定（引物a、b）的基础上，补充进行Cre酶是否发挥作用的鉴定（引物c）是非常重要的。

这里不仅要关注Cre酶是否发挥作用，同时也要关注Cre发挥作用后，loxP位点是否仍然存在（一般我们进行基因型鉴定所选取的组织中都会包含两部分细胞，一部分细胞中表达Cre重组酶，另一部分细胞中不表达。因此我们的鉴定结果中理论上都应该能够检测到确定loxP位点敲入的条带，即图B中的"Flox"位置条带和图C中的"KI"条带）。

· 全面鉴定的重要性

对每个子代的基因型进行WT、Floxed和KO/KI/Rec等位基因的检测，是确保所有动物都有其预期基因型的关键方法。如果观察到重组等位基因，想要确认是否发生了种系重组，可以通过检测Cre阴性的子代来排除鼠尾或鼠耳中有Cre表达时会观察到的嵌合重组现象。

重点是减少非预期重组。由于存在不同靶基因对Cre重组酶的敏感性差异，因此细胞类型特异性的重组模式也必须在感兴趣的靶基因位点上进行确认，而不仅仅是在一个单独的报告基因位点上。因此，通过原位杂交和/或免疫染色来验证感兴趣区域的目标，对于确认细胞类型的特异性和局部重组的效率非常重要。

4. 南模生物相关资源

南模生物长期致力于基因修饰动物模型研发，为科研用户提供全方位模式生物服务，包括饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台。在Cre-LoxP系统应用方面，南模生物可提供：

Find CRE工具鼠数据库：涵盖数千种Cre工具小鼠的表达谱和验证数据，帮助您快速找到合适的Cre品系

条件性敲除小鼠定制：根据您的研究需求，定制携带Floxed序列的基因敲除小鼠

报告基因工具鼠：提供多种报告基因小鼠模型，用于谱系示踪和细胞标记

基因型鉴定服务：专业的鉴定团队，帮助您准确判断是否发生种系重组

种系重组相关的知识比较复杂，我们将在后续的推文中持续为您介绍，例如Cre品系与报告小鼠配繁相关的种系重组问题、嵌合重组及受精卵重组与种系重组的区分等。如果您在使用Cre小鼠时遇到任何问题，欢迎随时联系我们咨询。

关于我们

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。

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参考文献：

[1] Song, A. J., & Palmiter, R. D. (2018). Detecting and Avoiding Problems When Using the Cre-lox System. Trends in genetics : TIG, 34(5), 333–340.

[2] Luo, L., … Craig, A. M. (2020). Optimizing Nervous System-Specific Gene Targeting with Cre Driver Lines: Prevalence of Germline Recombination and Influencing Factors. Neuron, 106(1), 37–65.e5.

[3] Spinelli, V. et al. (2015) Screening strategy to generate cell specific recombination: a case report with the RIP-Cre mice. Transgenic Res. 24, 803

[4] Madisen, L. et al. (2010) A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat. Neurosci. 13, 133–140

[5] Srinivas, S. et al. (2001) Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4

[6] Feng, G. et al. (2000) Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron 28, 41–51