在生物学研究中，你是不是经常会碰到这类问题：

1. 想要对表达目的基因的细胞进行示踪，不知如何将目的基因与荧光蛋白进行连接？

2. 想要用一个载体同时表达多个基因，不知如何将多个基因进行连接？

其实要解决上述问题，通常有这么几种方法：

● 构建多个表达框，用多个启动子启动多个转录本转录以表达多个基因；

● 在基因之间插入蛋白水解切割位点，利用蛋白水解加工（proteolytic processing）的方法对同一个转录本翻译的融合蛋白进行分离；

● 在基因之间插入内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）；

● 在基因之间插入自剪切多肽2A（self-cleaving 2A peptide，2A）结构。

其中应用最广泛，最成熟的是采用多顺反子表达的方案，也就是我们经常遇见的用IRES和2A元件连接前后两个基因。

那在具体的实验设计中，IRES和2A元件要怎么选择，他们各自有什么优缺点，我们接着往下看。

IRES元件

真核生物的蛋白翻译主要依赖于mRNA的5’帽子结构。但在真核生物和一些RNA病毒中也存在一些例外情况，如对于缺乏帽子结构的RNA病毒，其蛋白合成起始是依赖于5’端非编码区的一段特殊的序列，这段非编码mRNA即IRES。IRES的存在允许核糖体直接结合mRNA起始翻译。因此，当在两个基因中间插入IRES元件，上游蛋白依靠5’帽子结构起始翻译，下游蛋白则依靠IRES起始翻译。

当前，IRES应用很广泛，主要是因为IRES上下游的两个蛋白可以同时表达，并且翻译出的两个蛋白是完全独立的。但是IRES也存在不足的地方，主要涉及如下方面：

1. IRES的序列较长（约600bp），无法像原核SD序列一样通过引物扩增添加，其应用常受到载体容量的限制；

2. 无法实现IRES前后两个蛋白的等量表达，IRES的存在有可能会影响mRNA的结构，加上IRES和mRNA的 5’帽子对核糖体/翻译起始复合物的结合力不同。通常情况下，下游蛋白的表达量仅为上游蛋白的10%~50%。

那么如何能够实现上下游蛋白的等量表达呢？下面这个元件可以给你帮助。

2A元件

2A肽是Ryan和他的同事在口蹄疫病毒（FMDV）中首次发现的一种“自我切割”的小肽，此外在其它病毒中也发现了2A肽类似序列，其平均长度为18-22个氨基酸，且具有高度保守的C末端序列：-DxExNPGP- 。2A元件会导致核糖体跳过2A肽C末端的甘氨酰（G）— 脯氨酰（P）肽键的合成，从而“断裂”为两个独立的蛋白。这个过程被形象地称为“核糖体跳跃”。

2A肽的剪切效率极高，昆虫病毒和猪捷申病毒中的2A切割效率几乎是100%，因此使用2A肽作为连接元件，能够实现多蛋白的等量表达。另外，2A肽长度小，一个典型的序列为EGRGSLLTCGDVEENPG*P（*为切割位点），其DNA序列为54bp，可以通过长引物PCR将其引入基因中的。2A的应用非常广泛，尤其是连接多个基因的时候，优势更加明显。当然也可以将2A及IRES结合使用。查找Addgene现有载体构建数据，对于三基因、四基因之间的连接，连接元件组合使用频率：2A/2A >2A/IRES> IRES/IRES。

目前已经鉴定出多种2A多肽，其中常用的有4种：F2A（口蹄疫病毒），E2A（马鼻炎A病毒），P2A（ 猪圆环病毒1），T2A（TaV）。为比较4种2A的切割效率，研究人员将构建的sCMV-NLS-EGFP-2A-mCherry-CAAX质粒分别转染HEK293T，HT1080，Hela细胞系，斑马鱼胚胎；将sCMV-NLS-EGFP-2A-mCherry-CAAX包装成腺病毒，对小鼠进行尾静脉注射，观察其表达情况。结果发现：无论是在人细胞系，还是在斑马鱼胚胎中，或小鼠组织中，P2A的切割效率均是最高的。这为我们更好地应用的2A结构提供了更明确的证据。

当然2A肽也存在一定缺点，由于断裂发生在2A多肽C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间，所以，上游蛋白会多出20余个氨基酸的多肽尾巴，下游蛋白会在N端多出一个脯氨酸。这种额外增加的2A肽结构可能会对目的蛋白的功能造成一定的影响。

简而言之，IRES元件可以实现“同时转录，独立翻译”，2A 肽可以实现“同时转录，同时翻译”，两者都可以用于多蛋白的同时表达。但由于IRES和2A 肽都有着各自的优缺点，建议参考目的蛋白的相关文献报道，或依照经验进行构建。

Reference：

[1] Martinez-Salas E, Francisco-Velilla R, Fernandez-Chamorro J, Embarek AM. Insights into Structural and Mechanistic Features of Viral IRES Elements. Front Microbiol. 2018 Jan 4;8:2629.

[2] Kim JH, Lee SR, Li LH, Park HJ, Park JH, Lee KY, Kim MK, Shin BA, Choi SY. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 2011;6(4):e18556.

[3] Burén S, Ortega-Villasante C, Otvös K, Samuelsson G, Bakó L, Villarejo A. Use of the foot-and-mouth disease virus 2A peptide co-expression system to study intracellular protein trafficking in Arabidopsis. PLoS One. 2012;7(12):e51973.