生殖健康研究（附模型推荐）
根据中国人口协会、国家卫健委发布的数据显示，中国育龄夫妇的不孕不育率从20年前的2.5%~3%攀升到近年的12%-15%左右，不孕不育者约有5000万人。据相关机构预测，到2023年，中国育龄人群整体不孕不育率将会达到18.2%，育龄人群的生育状况不容乐观，本文总结了影响不孕不育的相关因素和相关动物模型，以期促进不孕不育的机制研究和药物研发。
图1 不孕不育的发生率[1]
01
生殖系统简介
1.1 男性生殖系统
男性生殖系统包括外部生殖结构和内部生殖结构，外部部分包括阴茎、阴囊和睾丸。其中睾丸通常位于阴囊中，由众多的生精小管构成，是精子发生的部位。生精小管间具有间质细胞，能分泌雄性激素促进生殖器官发育、成熟和第二性征的形成及维持。生精小管经输出小管到达附睾。
附睾是大而卷曲的管，精子在这里经过重要发育阶段而成熟。附睾下端经输精管而达于尿道。精液经尿道、阴茎而通体外。男性的内部生殖器官包括输精管、射精管、尿道、精囊、前列腺和尿道球腺。精囊腺、前列腺和尿道球腺是重要的附属腺体，它们的分泌物构成精液的主体，所含的营养物质，能促进精子的活性。
图2 男性生殖系统[2]
精子发生是男性执行生育功能的关键事件之一，成熟精原干细胞在睾丸微环境中通过一系列发育过程分化为成熟精子。睾丸组织中的体细胞微环境主要由支持细胞（Sertoli cell）、间质细胞（leydig cell）、管周肌样细胞（myoid cells）和睾丸巨噬细胞（macropahge）共同形成[3]。
支持细胞是生精小管的上皮支持细胞，呈高大的柱状，从基底膜延伸到管腔，它们围绕着增殖和分化的生殖细胞。主要功能是为精子提供毛细血管来源的营养，形成血-睾丸屏障，产生有助于精细胞成熟的睾丸液。间质细胞位于生精小管之间，细胞质中含有许多胆固醇脂滴。间质细胞制造和分泌睾酮，进而促进精子的产生、附属性腺的分泌和男性次要特征的获得。管周肌样细胞是鳞状可收缩的细胞，可促进精子的运输。睾丸巨噬细胞能够促进精原细胞的维持，并阻碍其它免疫系统物质进入睾丸组织。
图3 生精小管和小管外间质组织中的细胞[4]
1.2 女性生殖系统
女性生殖系统也包括外部生殖结构和内部生殖结构，外部生殖结构包括阴阜、大阴唇、小阴唇、阴蒂、阴道前庭，内部生殖结构包括阴道、子宫、输卵管及卵巢。卵巢是卵子发生的部位，存在数量众多的处于不同发育阶段的滤泡。每个滤泡内含有一个卵细胞，滤泡液含有雌性激素，能促进生殖管道、乳房的发育以及第二性征的成熟。卵子成熟后，滤泡破裂，卵及滤泡液一起排出。所残余的滤泡即逐渐缩小，并由一种黄色细胞所充满，成为黄体。成熟卵排出后，进入输卵管前端的开口（输卵管伞），沿输卵管下行达于子宫，受精作用发生于输卵管上段。已受精的卵将植于子宫内壁上，在这里接受母体营养而发育。
图4 女性生殖系统[5]
卵巢是雌性执行生殖功能的主要器官，卵巢中有五种主要的细胞类型：颗粒细胞（GC），卵泡膜细胞（TC）和基质细胞，平滑肌细胞，内皮细胞和免疫细胞[6]。
卵巢颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵泡的生长启动、发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动。卵泡发育的显著标志之一就是颗粒细胞迅速生长及增殖，而成年动物的卵泡闭锁主要是由颗粒细胞凋亡引起，尤其在卵泡发育后期，此外，颗粒细胞还与卵泡膜细胞共同完成卵巢激素的合成，维持着有利于卵母细胞生长和成熟的微环境。
卵泡外膜则由一层或多层平滑肌细胞构成，接受自主神经支配，促使其收缩，其精确作用尚不清楚，但平滑肌细胞的收缩与排卵及卵泡闭锁有关。卵巢的血管重塑支持着滤泡生长和变性，内皮细胞参与血管重塑过程。卵巢含有多种免疫细胞，如巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞、粒细胞等，可分泌可溶性调节因子，单独或联合调节卵泡发生、排卵和黄体形成。
图5 卵泡成熟过程
南模生物在小鼠生殖系统特定细胞类群marker基因中敲入Cre/Dre 等重组酶元件，可以在特定细胞群里进行基因及细胞功能的研究。具体模型信息见下表：
02
影响不孕不育的遗传因素
男性的不育最常由精子发生障碍引起，临床上称为少精子症或无精子症。男性不育致病因素复杂（见图6），目前已知的主要因素包括遗传因素、抗精子抗体、感染、内分泌因素、疾病、锌缺乏、环境、饮食和吸烟等。在少精子症、弱精子症及非梗阻性无精子症发生的因素中，遗传因素占到了大约30%，其中包括基因突变和染色体异常[7]。
图6 男性不育相关因素致病过程模式图[7]
X、Y染色体作为决定性别发育的重要染色体，其结构、数量变化及其基因仍是学术界研究男性不育的重点。例如，Y染色体上存在的精子发生相关基因——无精子因子（AZF）区，是最常见的染色体微缺失区域。相关基因则有无精子缺失基因（DAZ）、RNA结合基序基因（RBMY）、USP9Y基因。X染色上的关键基因则有雄激素受体（AR）、Anos1、Rhox及USP26等。此外，位于常染色体上的CFTR基因纯合子突变会引起男性先天性双侧输精管缺失，导致阻塞性无精子症。其它关键基因还有INSL3-RNFP2、SYCP3、KLHL10、AURKC等。线粒体DNA的缺失也对男性生育有一定的影响[7]。
对于女性而言，引起不孕症的因素以生殖系统相关病变居多，主要为子宫病变和卵巢病变，此外机体免疫功能异常（即产生致病性抗体如抗精子抗体、抗卵巢抗体等）及社会-心理-精神因素对不孕症也有明显影响[8]。近来发现，单基因变异与女性不育也有一定的关系。
图7 2015年我国女性不孕的主要原因构成[9]
46,XY性腺发育不全又称之为Swyer综合征，主要与参与性别决定过程中的基因突变有关，例如NR5A1，MAP3K1，GATA4，FOG2基因突变。NR5A1编码的转录因子，可调控性腺发育和生殖相关的基因表达，该基因突变后将导致性腺发育不全。SRY基因一直被认为是性腺发育途径中的关键基因，约有15%的46,XY 患者携带SRY基因突变。最近发现DHX37基因也与性腺发育不全有关。
此外，BMP15在卵巢早衰病中起到决定性的作用，缺失突变后在纯合状态下引起卵巢功能不全。NOBOX、FLGLA、EIF4ENIF也与卵巢早衰病有关。LHCGR、ZP基因则与空卵泡综合征有关[10]。
03
不孕不育小鼠模型
目前不孕不育的临床治疗主要依靠辅助生殖技术，但其存在费用高、操作繁琐以及高多胎率等一系列亟待解决的问题。因此，研究不孕不育的发病机制并针对病因给予治疗是今后的主要研究方向。通过构建不孕不育小鼠模型，将有助于疾病机制的研究和临床治疗。
3.1 雄性不育小鼠模型[11]
雄性不育小鼠模型可以通过物理方法（例如，热刺激、辐射效应）、化学方法（例如，化疗药物诱导）、手术方法（实验性隐睾、手术致精索静脉曲张）以及基因敲除的方法构建。这里主要介绍下基因敲除小鼠模型。Xrcc1是一种重要的DNA修复基因，在精子发生早期高度表达。Xrcc1基因敲除小鼠与野生型小鼠比较，睾丸体积更小、精子活性减弱、生精小管数量减少，且诱导睾丸活性氧水平升高，损害精子和精原干细胞。雄激素和雄激素受体（AR）促使睾丸发挥正常生理功能。AR敲除小鼠生殖细胞发育不完整，导致无精子症及不育。MIWI蛋白是RNA诱导沉默复合体（RISC）的核心元件-Argonaute蛋白家族成员之一，敲除Miwi后，会造成小鼠精子产生明显缺陷，表现为雄性不育。
3.2 雌性不育小鼠模型
雌性不育的疾病类型较多，本文着重总结了人群中多发的多囊卵巢综合征和卵巢早衰相关小鼠模型。
多囊卵巢综合征小鼠模型[12]
多囊卵巢综合征（PCOS）是女性不孕不育的主要原因之一。在过去几十年里，PCOS的动物模型主要由人工诱导而成，例如雄激素诱导和高脂饮食。有研究者认为，不同基因背景的小鼠对脱氢表雄酮（DHEA）（雄激素的一种）诱导的反应存在一定的差异。DHEA在C57BL/6J背景下诱导的PCOS小鼠模型比BALB/c在代谢方面更接近于PCOS患者。
现在有研究者认为PCOS表现为多基因相关性，通过构建多基因型小鼠可模拟PCOS症状。瘦素缺乏和瘦素受体缺乏小鼠表现出一系列的类PCOS的生殖和代谢特征，但没有呈现卵巢多囊化。而下丘脑瘦素受体和胰岛素受体特异性敲除小鼠，则表现出明显的代谢紊乱和卵巢形态改变，与正常小鼠相比有较多的退化卵泡。雌激素受体α和芳香化酶CYP19敲除小鼠，卵巢出现囊性出血，不排卵。
此外，过表达人纤维溶酶原启动物抑制剂-1小鼠，出现了不排卵、黄体缺失的现象，且有50%以上的雌鼠出现了卵巢多囊化。卵巢过表达神经生长因子（NGF）的小鼠可以导致卵泡在窦性卵泡期出现闭锁、凋亡增加、小的生长卵泡积累，LH水平有轻度的持续性升高，这使卵巢多囊化的几率增加。总结如表1。
表1：不同基因修饰PCOS小鼠模型的特征[12]
卵巢早衰动物模型[13]
近年来，卵巢早衰（POF）（又称为早发性卵巢功能不全（POI））的发生率每年上升，且不断向低龄化趋势发展，成为中国女性不孕的常见病因之一。根据POF不同的发病机制,目前已经成功构建的模型有：基因敲除模型、自身免疫模型、放疗模型、化疗药物模型、卵巢切除模型、D-半乳糖模型以及环境损伤模型等。这里主要介绍基因敲除模型。
随着分子生物学的发展，学者们发现了与POF发生相关的基因，包括脆性X智力低下基因 1（FMR1）、骨形成发生蛋白15基因（BMP 15）、生长分化因子9基因（GDF9）、叉头框L2基因（FOXL2）等。FOXL2是调控基因表达的关键转录因子，在颗粒细胞的发育过程中发挥重要作用，敲除雌性小鼠FOXL2基因后，发现小鼠颗粒细胞停止生长，随后卵母细胞死亡，大量卵泡闭锁，生育能力降低。BMP15 通过促进卵母细胞发育、防止颗粒细胞凋亡，参与促进卵泡生长和成熟；BMP15基因敲除雌性小鼠生育能力明显下降。
表2：各种常见POF动物模型建模方法比较[13]
南模生物优吉鼠模型资源库含多种自主构建的不孕不育研究大小鼠模型，可用于不孕不育症的基础研究和药物开发，详细模型信息见下表：
*临床相关性代表目的基因的同源人类基因在临床上报道过与该生殖系统疾病有相关性。
#品系表型预测代表有文献报道过具有类似基因型的小鼠出现过该生殖系统疾病的表型。
南模生物深耕基因编辑领域，提供全方位模式生物服务，包括基因修饰成品模型供应、个性化模型定制、饲养繁育、表型分析、药效评价等，满足不同实验室需求。
参考文献:
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