小胶质细胞基因靶向模型:Tmem119-CreERT2


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小胶质细胞是位于大脑中的巨噬细胞,主要负责中枢神经系统 (CNS) 的免疫防御,对维持大脑内稳态有着重要作用。

然而,由于缺乏合适的研究工具,当前的研究方法很难区分小胶质细胞及脑内其它巨噬细胞,因此,人们对小胶质细胞功能机制的深入研究受到了一定的限制。

之所以很难区分小胶质细胞及脑内其它巨噬细胞,是因为这些巨噬细胞同源,许多标记物都相同,如整合素 α M (ITGAM/CD11b)、表面糖蛋白 F4/80、造血标志物CD45、溶酶体蛋白CD68、离子钙接头分子(Iba)-1, Cx3趋化因子受体1(Cx3cr1)、MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶(MerTK)等。

事实上,早前出现的Cx3cr1-Cre和Cx3cr1-CrERT2品系都是标记所有CNS巨噬细胞,并不能区分小胶质细胞和脑内其它巨噬细胞。

因此,使用Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CrERT2品系通常将CNS中所有巨噬细胞的混合体作为整体进行评估,而不是只针对小胶质细胞这一类进行研究。

此外,现有的转基因品系如Sall1-GFP、Sall1-CreERT2、Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CreERT2通常是替代性敲入策略产生的,即表达外源性敲入的序列,内源性基因不表达,但是该类策略有可能会影响小胶质细胞的表型,因此,迫切需要新的基因工具来对小胶质细胞进行研究。

为此,南模生物自主研发,构建了一种新的小胶质细胞基因靶向模型,Tmem119-CreERT2工具小鼠,该小鼠可用于特异性研究小胶质细胞的功能。

 

TMEM119蛋白的发现

早在2016年,斯坦福大学医学院Mariko L. Bennett等人在顶尖杂志PNAS发表了一篇文章,对小胶质细胞的特异性标志物进行了深入探究。

作者筛选出7个(Tmem119、Fcrls、P2ry12、P2ry13、Gpr34、Gpr84、Il1a) 候选基因,通过原位杂交,发现TMEM119特异性在鼠源和人源的小胶质细胞上大量表达(Fig1),在脉络膜丛和脑膜巨噬细胞,血管周围细胞中均没有表达。

另外,qPCR结果显示TMEM119在CNS CD45+细胞中高表达,在骨髓、脾脏、肝脏和血液中不高表达。

所有这些数据表明:TMEM119在小胶质细胞中高表达且仅限于小胶质细胞,TMEM119确实可以作为小胶质细胞高度特异性的marker。随后,TMEM119抗体被广泛用作免疫组化方法的金标准。

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Fig1. 免疫荧光检测TMEM119在小胶质细胞中特异性表达。

2019年,Tobias Kaiser等通过CRISPR/Cas9技术插入2A-EGFP基因盒,使得TMEM119和EGFP的表达受到内源性Tmem119基因的控制,利用免疫荧光染色、免疫荧光成像等技术对小鼠脑组织中表达EGFP的细胞进行分析,结果发现:除小胶质细胞外,脉络膜丛和脑膜巨噬细胞,血管周围细胞中均没有EGFP的表达(Fig2. A-F)。

为了进一步验证EGFP在小胶质细胞中的特异性,作者使用了流式细胞术,通过检测CD45+EGFP+细胞,他们确定99.6% 的细胞是对应于小胶质细胞的CD11b+CD45lo细胞(Fig2. H)。对2212个非小胶质细胞CD11b+CD45int/hi进一步检测,发现仅有153个细胞表达EGFP(6.9%)( Fig2. G-I)。

综上数据表明,Tmem119-EGFP可以特异性的区分小胶质细胞和脑内其他巨噬细胞。

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Fig2. Tmem119-EGFP 可特异性区分小胶质细胞及脑内其它巨噬细胞。

此外,Tobias Kaiser等科学家还证明Tmem119位点可被用于Tamoxifen诱导Cre介导的小胶质细胞基因操作和小胶质细胞的谱系追踪,且可排除其它巨噬细胞的影响。

作者将Tmem119-CreERT2小鼠与Ai14报告小鼠进行杂交,经Tamoxifen处理后,对小鼠进行免疫荧光染色。

结果发现,Tamoxifen诱导后,IBA1标记的小胶质细胞会表达红色荧光 (Fig3. B-D),未经Tamoxifen诱导的小鼠则没有tdTomato表达 (Fig3.E-G)。

另外研究还发现,中枢神经系统的其他主要细胞类型,如少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞中都没有tdTomato表达 (Fig3.H-J)。


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Fig3. Tmem119-CreERT2小鼠在小胶质细胞中具有高效的重组效率。

 


Tmem119-CreERT2小鼠的构建

我们利用CRISPR/Cas9技术在Tmem119基因的终止密码子前插入了2A-CreERT2基因盒,使得Cre重组酶具有Tmem119启动子特异性,且需要tamoxifen的存在才能激活。

通过将Tmem119- CreERT2与荧光报告基因小鼠基因交配发现,Tamoxifen诱导的Tmem119- CreERT2系可以在很长一段时间内对小胶质细胞产生稳定的遗传修饰。


Tmem119-CreERT2小鼠的验证

为了评估Tmem119-CreERT2小鼠诱导后在小胶质细胞中是否有Cre活性,我们将Tmem119-CreERT2小鼠与R26-LSL-tdTomato报告小鼠进行杂交。

实验表明:无Tamoxifen诱导的对照组中,检测不到tdTomato的表达,只有经Tamoxifen诱导后,小胶质细胞才能够表达tdTomato(Fig4. A-B)。

此外,在少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞中都检测不到tdTomato表达(Fig4. C-D),该结果与已有报道的信息是相符的,提示该小鼠是研究小胶质细胞研究的有力工具鼠。  


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Fig4. Tmem119-CreERT2小鼠在小胶质细胞中具有高表达。

A. 经Tamoxifen和玉米油分别处理,荧光检测Tmem119-CreER;R26-tdTomato小鼠中tdTomato的表达情况。

B. 荧光检测Tmem119-CreER;R26-tdTomato小鼠IBA1 阳性细胞中有tdTomato的表达。

C. 荧光检测Tmem119-CreER;R26-tdTomato小鼠小胶质细胞(Tmem119,Tdtomato)与星形胶质细胞(GFAP, green)共定位。

D. 荧光检测Tmem119-CreER;R26-tdTomato小鼠小胶质细胞(Tmem119,Tdtomato)与神经元(NeuN, green)共定位。

(Scale bar=10μm Hippo: Hippocampus; Str: Striatum; Sn: Substantia nigra.)


综上所述, Tmem119在小胶质细胞高度特异性表达的特性,使其可作为区别于遗传特征相近的CNS髓细胞和外周血中的髓细胞的marker基因/

本文构建的可诱导的Tmem119-CreERT2是一个很好的体内模型,可以在特定的时间点对小胶质细胞特异性基因进行研究,为探索小胶质细胞开辟了新的途径。

目前该小鼠是活体供应的状态,欢迎研究小胶质细胞功能的老师咨询及订购。


Reference:

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2. Kaiser T, Feng G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 Transgenic Mice for Labeling and Manipulating Microglia. eNeuro. 2019 Aug 26;6(4):ENEURO.0448-18.2019. doi: 10.1523/ENEURO.0448-18.2019. PMID: 31371457; PMCID: PMC6712208.

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