Cre-lox系统介绍及使用汇总

2020-06-28 16:55 by 南模生物


你一定听说过Cre-lox重组系统,无论你是否直接进行过基因操作。由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率高的优点,如今已经成为体内外遗传操作的强有力工具。利用Cre-lox系统,可以在特定细胞、组织或整个生物体,甚至在特定时间点敲除或表达某个基因,实现对特定基因的时空特异性操作,这对基因功能的研究和人类疾病动物模型的建立都具有深刻影响。


什么是Cre-lox系统?

从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分:

Cre重组酶

环化重组酶(Cre, cyclization recombinase),是酪氨酸位点特异性重组酶之一,能催化两个DNA识别位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶来源于P1噬菌体,由 343个氨基酸组成,能特异性地识别Lox位点。除Cre以外,此类重组酶还有Flp(flipase)和Dre(D6特异性重组酶)。

Lox位点

Cre重组酶识别的回文DNA位点,也叫loxP (locus of X-over P1) 位点,长 34bp,其特征结构为ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列,中间的8个碱基为重组发生位置,这也决定了loxP的方向。N表示可变碱基,不同的碱基选择可形成不同的 Lox位点,除了野生型loxP,常见的还有 Lox2272,Lox511,Lox5171等等,这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别,但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发生重组。

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图1 . loxP位点及其突变体位点。(图片来自Ref.1)


在同一个 DNA 分子上,根据Lox位点的位置与方向,可能会发生3种不同的重组事件:

(1)切除:当两个Lox位点在同一染色体上且方向相同时,将切除同向Lox位点之间的DNA序列(也叫Lox侧翼序列,Flox序列)。

(2)反转:当两个Lox位点位于同一染色体上且方向相反时,两个Lox位点之间的序列发生序列反转,即颠倒。

(3)易位:如果两个Lox位点位于不同的染色体上且方向相同,则易位事件将导致DNA片段的交换。

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图2. Cre的重组机制。A)loxP位点的基本结构。红色箭头指示loxP位点的方向。B)Cre-loxP介导的易位重组。C)左图示Cre介导两同向loxP位点间的切除重组。右图示Cre介导两反向loxP位点间的反转重组。(图片来自Ref.2)


条件性基因打靶小鼠:体内Cre-lox系统的基础应用

利用Cre-lox系统在小鼠体内实现对基因的时空特异性打靶(表达或敲除),原则上需要建立两种小鼠。

首先,建立特异性Cre小鼠,该小鼠中的Cre重组酶由特定启动子驱动,可在特定细胞或组织或全身表达Cre重组酶。Cre重组的特异性由驱动Cre的启动子或增强子控制。

其次,需要建立Flox小鼠,即在该小鼠靶基因序列侧翼带有Lox位点。将上述两种小鼠杂交繁育,子代中可以获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠,即条件性基因打靶(表达或敲除靶基因)小鼠。


条件性基因表达

在小鼠中, Cre-lox系统最初被用于在特定细胞群中打开基因的表达。条件性基因表达所需要的Flox小鼠,一般带有一个沉默的转基因,也就是说在靶基因与启动子之间有一个“终止盒”(lox-stop-lox)。这个“终止盒”通常由强polyA信号和/或剪接供体序列构成,能阻止转基因的转录。这些Flox小鼠与细胞类型特异性表达Cre的转基因小鼠交配后获得的子代小鼠中,在每个表达Cre重组酶的细胞中,终止盒被Cre切除,因此仅在这些细胞中表达所需的转基因。

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图3. 条件性基因表达小鼠原理示意图。(图片来自Ref.3)


条件性基因敲除

条件性基因敲除所需要的Flox小鼠,一般在需要切除的DNA片段两侧带有同方向的两个Lox位点(lox-GENE-lox)。与细胞类型特异性Cre小鼠交配后,Cre 重组酶会识别Lox位点,导致靶基因被敲除。由于 Cre 基因的表达受上游启动子的调控,因此启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。

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图4. 条件性基因敲除小鼠原理示意图。(图片来自Ref.3)


更精准的诱导型Cre-lox系统

为了能够更准确地进行遗传功能研究,时间特异性的Cre-lox(也叫诱导型Cre-lox)被开发出来,可用于研究生物体发育过程特定阶段的基因功能,或用来进行谱系示踪等。常用诱导型Cre-lox系统有:


CreER系统

也叫他莫昔芬(Tam)诱导的Cre系统。将Cre与雌激素受体ER融合,可通过他莫昔芬(Tam)诱导Cre的重组活性。在没有他莫昔芬的情况下,CreER融合蛋白与热休克蛋白90(HSP90)相互作用并存在于细胞质中(图5.1)。给予他莫昔芬药物处理会破坏HSP90与CreER的相互作用(图5.2)。ER与Tam的相互作用诱导Cre的核易位(图5.3)。在细胞核中,CreER识别loxP位点(图5.4)并使组织X中的基因Y失活(图5.5)。CreERT2在体内对药物诱导的敏感性更高,因此一般优选使用CreERT2。

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图5. 他莫昔芬(Tam)诱导的Cre系统。(图5-7来自Ref.4)


Cre;Tet系统

四环素诱导系统,也叫强力霉素(Dox,四环素衍生物)诱导的Cre系统。该系统有两种模式:Tet-on和Tet-off,分别是Dox依赖性Cre的激活和Dox依赖性Cre的失活。Tet系统包括以下元件:反向四环素控制反式激活因子(rtTA);四环素控制反式激活因子(tTA);四环素响应元件(TRE),通常是19个核苷酸的四环素操纵子(tetO)序列的7个重复,调节Cre基因的表达。Dox通常在小鼠的饲料或饮水中进行给药。

Cre;Tet-on系统

在Tet-on系统中,表达普遍存在的或组织特异性的启动子驱动的rtTA。在没有Dox的情况下,失活的rtTA无法与负责调控Cre基因的TRE序列结合,则Cre不表达。在Dox给药之后,Dox结合并激活rtTA。激活的rtTA与TRE序列结合并诱导Cre表达。

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图6. Dox诱导的Cre;Tet-on系统。Dox给药才能打开Cre表达。

Cre;Tet-off系统

另一方面,在Tet-off系统中,在没有Dox的情况下,激活的tTA能够结合Cre前的TRE序列并诱导Cre表达。而在Dox给药后,与Dox相互作用的tTA被灭活。灭活的rTA不再与TRE结合,因此Cre表达受到抑制。

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图7.  Dox诱导的Cre;Tet-off系统。Dox给药后关闭Cre表达。


Cre-lox系统的常见问题


Cre小鼠的建立方法对Cre表达的影响

早期Cre小鼠的建立主要通过随机转基因的方式,将外源特异性启动子连同Cre基因序列随机地整合到小鼠基因组中。这些随机转基因方法虽然可以筛选到细胞特异性表达的Cre小鼠品系,但是由于Cre整合的随机位点和基因拷贝数的不可控,Cre重组酶的表达很可能会受到染色体状态的影响,如DNA甲基化导致Cre的沉默。

因此,更为可靠的方法是通过基因打靶(ES细胞同源重组或CRISPR/Cas9途径)的方式将单拷贝的Cre基因定点整合到内源基因座中,受内源基因表达调控。

这样一般有以下3种做法:

(1)Cre表达框直接插入到内源基因起始密码子前;

(2)Cre连接在2A自剪切序列之后,插入到内源基因终止密码子位置;

(3)Cre连接在内部核糖体进入位点(IRES)之后,插入到内源基因终止密码子之后。

第一种做法(1)在表达Cre重组酶的同时会破坏内源基因的表达。有些基因的杂合子和纯合子表达基因量不同导致下游信号强度差异。第三种做法(3),IRES介导的翻译通常会导致Cre的表达强度衰减。此外,应尽可能避免破坏内源基因3‘UTR,防止影响表达后修饰。因此,在建立新的Cre小鼠时,测试并记录新Cre小鼠中Cre的表达模式是非常有必要的。

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图8.  Cre表达框直接插入到内源基因起始密码子前,在表达Cre重组酶的同时会破坏内源基因的表达。

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图9. 将Cre基因定点敲入到内源基因的3‘端,建立共表达Cre小鼠。


如何测试一个新的Cre小鼠品系

通常我们会利用Reporter小鼠与Cre小鼠杂交来验证Cre的表达谱。Reporter小鼠一般是在Rosa26位点插入带有lox-stop-lox终止盒以及报告基因(LSL-R)的一种工具小鼠,只有Cre酶介导重组切除终止盒后,才会有报告基因的表达。例如需要验证GeneX-Cre定点整合小鼠,可将Cre杂合子小鼠(GeneXCre/wt)与Reporter杂合子(Reporter lox/wt)或纯合子(Reporterlox/lox)小鼠交配,通过免疫组化、免疫荧光或原位杂交来判断Cre阳性的子代小鼠(GeneXCre/wt ; Reporter lox/wt)报告基因是否在已知表达GeneX的细胞中表达,从而了解Cre的特异性表达是否与预期的一致。

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图10. 用Reporter小鼠验证Cre小鼠示意图。(图片来自Ref.6)


影响Cre对lox位点重组效率的因素

Cre重组酶的重组效率并不是100%的,也就是说当Cre小鼠与flox小鼠交配后,特定组织中只有部分细胞中发生重组,因此会产生嵌合模式。

lox位点的放置位置会影响重组效率。只有两个lox位点相遇才能在Cre作用下发生位点特异性重组,而两个lox位点相距越远,它们相遇的概率就越低,导致重组效率也就越低。因此,在设计条件性基因打靶策略时,需要考虑基因结构与flox区域的长度,来降低重组失败的风险。

Cre的表达量并不等同于Cre对lox位点的重组效率。很多时候由于基因组调控的复杂性,以及每个基因在不同细胞内染色质状态不同,Cre对于不同基因位点的Loxp切割效率并不一致。甚至有可能会出现同一种Cre小鼠对一种flox基因起作用,对另一种flox基因则不起作用的极端情况。而在使用Reporter小鼠指示Cre活性时,由于Reporter小鼠中lox位点与报告基因所在的基因组状态偏开放,从而使得Cre在Reporter小鼠中重组的效率会比对实际目标lox位点的重组效率要高一些。因此,Reporter小鼠验证的结果可以作为一种参考,但不是金标准。可以用多种不同的Reporter小鼠来检测Cre小鼠的特异性重组,反映出Cre重组酶对不同基因的重组效率可能是不同的。


Cre重组酶的意外表达

使用细胞特异性启动子控制Cre的表达可实现目标基因的选择性失活、激活或突变。通常我们希望Cre重组酶受启动子限制,仅在小鼠的部分细胞中发挥重组作用。但Cre的意外表达,或被称为“异位”表达仍时常发生,这些异位表达可能会导致一些我们不希望发生的重组。因此在建立Cre小鼠时选择谱系标志基因很重要。高特异性的谱系标志基因能高效精确地表达Cre,降低Cre漏表达或异位表达的概率。应尽量避免使用那些高表达但非特异的标志基因来构建Cre小鼠。

在使用Reporter小鼠验证组织特异性GeneX-Cre小鼠时,由于对GeneX本身表达谱的研究并不详尽,GeneX可能在生殖细胞或早期胚胎发育过程中存在瞬时表达,因此常常会发现报告基因的表达比预期的更为广泛。想要明确是否发生了生殖系中的Cre意外表达,可以通过将不同性别的子代小鼠(GeneXCre/wt;Reporterlox/wt)分别与野生型小鼠交配获得第二代。如果这些二代小鼠中报告基因的表达较第一代子代更为广泛,那么很有可能发生了Cre的生殖系表达。因为Cre介导的重组可能发生在配子形成的二倍体阶段,发生重组后的单倍体子细胞发育成胚胎,导致第二代子代小鼠即使没有Cre基因的整合,仍表达报告基因。

如果Cre小鼠发生了生殖系表达,那么在应用该Cre小鼠进行条件性基因打靶时,需要谨慎选择Cre小鼠的性别与交配方式以及对照组。比如,母系遗传的Cre小鼠品系,需要使用雄性带有Cre整合的小鼠进行繁殖;而父系遗传的Cre品系,则需要用雌性Cre阳性小鼠来繁育。当然,也可以通过使用诱导型Cre小鼠解决Cre生殖系意外表达的问题,实现仅在成年或胚胎发育晚期激活Cre重组活性,获得条件性基因打靶小鼠。


条件性基因敲除小鼠的繁育策略

要获得条件性基因敲除小鼠至少需要两步遗传杂交。第一步,将GeneX-Cre杂合子小鼠与GeneY-flox杂合或纯合子小鼠交配,获得的Cre与flox双阳性(GeneX Cre/wt; GeneY lox/wt)子代小鼠。第二步,将Cre与flox双阳性(GeneX Cre/wt;GeneY lox/wt)子代小鼠再与GeneY-flox杂合或纯合子小鼠交配,获得所需的GeneX Cre/wt; GeneY lox/lox小鼠为实验组。一般对照组为同窝GeneXwt/wt; GeneY lox/lox小鼠。如果Cre的整合破坏内源基因,那么应选择GeneX Cre/wt;GeneY wt/wt小鼠作为对照。

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图11. 条件性基因敲除的常规育种策略。

在进行基因型鉴定的时候,不仅要对小鼠鼠尾进行基因鉴定,对特异性目标组织也需要进行基因型检测。这时需要设计PCR引物方便区分野生型等位基因、flox等位基因和重组后的KO等位基因。在鼠尾鉴定时,如果发现重组后的KO产物,那么需要考虑该组织特异性Cre小鼠的生殖系表达问题。

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图12. 条件性基因敲除的基因型鉴定引物设计示意图。

之后需要检测重组后靶基因的mRNA和蛋白表达,来验证Cre-lox系统的工作效果。根据靶基因与lox位点的位置,可以设计qPCR模板或者探针来检测重组后的靶基因转录情况。进一步可以通过免疫组化检测条件性基因敲除后靶基因蛋白翻译是否缺失或异常。不过这很大程度上依赖于探针或抗体的灵敏度和特异性。


南模生物可提供超过200种自主产权Cre工具鼠和近500种自主产权成品Flox小鼠,有效缩短您的实验周期。


南模生物部分Cre品系验证数据


Myh6-Cre

Myh6特异性靶向小鼠心肌细胞,验证数据证明Myh6-Cre鼠是可以用于心脏特异性基因编辑的工具鼠。

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图13. 荧光检测tdTomato在Myh6-Cre; Rosa26 tdTomato 小鼠胚胎中的表达,结果表明在E13.5和E14.5天小鼠心肌细胞均有tdTomato表达。


Alb-CreERT2

Alb-CreERT2小鼠是研究肝脏基因功能与疾病的重要小鼠品系,验证数据证明Alb-CreERT2小鼠可以成为实现肝脏时间特异性敲除或表达的工具鼠。

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图14. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织X-gal染色。未使用他莫昔芬诱导的小鼠,肝细胞未被染色;使用他莫昔芬诱导的小鼠,肝细胞成功着色。

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图15. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织免疫荧光检测。Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠被他莫昔芬诱导后,LacZ(红色)表达。

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图16. Alb-CreERT2小鼠血生化检测。结果显示Alb-CreERT2小鼠与野生型小鼠相比肝功能正常。


Pvalb-Cre

Pvalb-Cre在中间神经元中表达iCre重组酶,而不干扰内源性Pvalb表达。这些小鼠可能对研究神经元分化有用。

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图17. 荧光检测Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠大脑皮层中间神经元tdTomato的表达。

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图18. 荧光检测Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠海马中间神经元tdTomato的表达。

结果显示:双阳性小鼠海马中间神经元有tdTomato的表达,表达类型符合预期。


Ucp1-CreERT2

Ucp1-CreERT2在棕色脂肪中表达CreERT2重组酶,验证数据证明Ucp1-CreERT2小鼠是可以用于棕色脂肪特异性基因编辑的工具鼠。

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图19. 荧光检测 Ucp1-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-  小鼠棕色脂肪和白色脂肪中 tdTomato 的表达。Ucp1-CreERT2 小鼠与 R26-tdTomato 小鼠进行交配,取棕色脂肪组织和白色脂肪组织进行荧光显微镜拍照。实验结果显示 Ucp1-CreERT2 小鼠经 Tamoxifen 诱导后可以在棕色脂肪中表达。


Tyr-CreERT2

Tyr-CreERT2特异性靶向黑色素细胞,验证数据证明Tyr-CreERT2鼠是可以用于黑色素细胞特异性基因编辑的工具鼠。

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图20. 荧光检测 Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-  小鼠尾部表皮基底层的表达情况。(A) R26-tdTomato+/-小鼠使用他莫昔芬诱导,表皮基底层的黑素细胞无红色荧光信号。B) Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射玉米油,表皮基底层的黑素细胞无红色荧光信号。(C) Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射他莫昔芬,表皮基底层的黑素细胞出现红色荧光信号。

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图21. Tdtomato表达位置图;结论:Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-  小鼠他莫昔芬诱导后表达在尾部皮肤基底层(白色虚线所示)的黑色素细胞(白色箭头所指)。

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图22. 皮肤结构模式图(图片摘自网络)



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