ProxCre、CrexER与dCreER：三种Cre重组酶优化策略如何解决谱系示踪中的异位表达问题

在谱系示踪实验中，单一 Marker 的异位表达是困扰研究者的核心难题。前几期我们介绍了通过改造报告基因工具鼠来提高标记特异性的方案，本期将聚焦另一条技术路线——对重组酶本身进行改造。roxCre、CrexER、dCreER 三种遗传策略，通过让一种重组酶调控另一种重组酶的活性，配合转基因小鼠和报告系统，实现了对 A⁺B⁺ 或 A⁺B⁻ 细胞群的精准标记，为遗传修饰动物模型在细胞命运研究中的应用提供了有力工具。

目录

roxCre 遗传策略

基本原理

[编码区插入 rox 会影响 Cre 效率吗？

roxCre 如何精确标记细胞群？

案例1：精准标记心内膜衍生成纤维细胞

CrexER 遗传策略

基本原理

案例2：精准标记冠状动脉内皮细胞

dCreER 遗传策略

基本原理

案例3：精准标记白色脂肪组织（WAT）

三种策略对比小结

领域前沿动态（2026）

1. roxCre 遗传策略

基本原理

roxCre 的核心设计是：在 Cre 编码区前或编码区中插入 rox-Stop-rox（RSR）序列。在 Stop 序列被移除之前，Cre 无法正确进行转录和翻译。

具体操作：将该转基因小鼠与另一个 Marker 基因启动的 Dre 小鼠交配后，Dre 介导 RSR 之间发生重组、将 Stop 序列去除，此时 Cre 才能正常发挥功能。

图1. roxCre 小鼠的两种类型

编码区插入 rox 会影响 Cre 效率吗？

有同学会问：当 RSR 插入 Cre 编码区时，即使通过 Dre-rox 重组去除 RSR，编码序列中仍会保留一个剩余的 rox 位点，这会不会影响 Cre 的重组效率？

中科院周斌团队对此进行了系统研究。研究者在 Cre 的 12 个不同位点分别插入了 rox 序列（大部分位于螺旋结构域之间），将这种包含剩余 rox 位点的 Cre 称为 mCre。通过用 12 个版本的 mCre（mCre1~mCre12）和相应的 GFP 报告基因转染细胞来筛选重组效率，结果表明：mCre1、2、3、4、6、7、10 和 11 的效率与传统 Cre 相当。

这说明，通过合适的插入位点设计，包含 rox 位点的 Cre 与普通 Cre 的重组效率可保持一致。

图2. 12种不同插入位点的mCre小鼠的重组效率检测 [2]

roxCre 如何精确标记细胞群？

若我们想标记 A⁺B⁺ 细胞，可以利用启动子 A 介导的 roxCre 小鼠、启动子 B 驱动的 Dre 小鼠、以及 LSL-Reporter 报告基因工具鼠进行交配：

图3. roxCre 小鼠的基因重组图解

· A⁺B⁻ 细胞或 A⁻B⁺ 细胞：无法被标记

仅 markerA 表达时，Cre 由于 RSR 的存在而无法转录翻译，细胞无法被标记。仅 markerB 表达时，Dre 酶无法重组 loxP 位点，细胞同样无法被标记。

· A⁺B⁺ 细胞：成功标记

markerB 介导 Dre 表达 → Dre 切除 roxCre 系统中两个 rox 位点之间的 Stop 序列 → markerA 介导 Cre 表达 → Cre 重组报告基因工具鼠的 loxP 位点，去除 LSL 中的 Stop 序列 → Reporter 基因表达，细胞被标记。

案例1：精准标记心内膜衍生成纤维细胞

损伤后出现的过多心肌成纤维细胞是组织纤维化的关键因素。经前期研究，心肌成纤维细胞主要来源于心外膜与心内膜。由于功能上的差异，研究者怀疑来自不同来源的成纤维细胞在心脏纤维化期间可能表现出不同的功能，因此需要准确标记不同来源的心肌成纤维细胞。

以心内膜衍生成纤维细胞为例，研究者利用心内膜细胞 marker Nfatc1 与成纤维细胞 marker Col1a2，构建了 Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP 转基因小鼠。

图4. Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP 小鼠的基因重组图解 [3]

关于 Col1a2-RSR-CreER，激活 CreER 需要 Dre 和 TAM 两者共同存在。在 TAM 诱导下，该小鼠可以标记 Col1a2 与 Nfatc1 双阳性细胞，即心内膜衍生成纤维细胞。

图5. 使用roxCreER准确标记心内膜衍生成纤维细胞 [3]

2. CrexER 遗传策略

基本原理

CrexER 策略的思路不同于 roxCre——它不是阻止 Cre 转录，而是利用雌激素受体（ER）将 Cre 锁在细胞质中。

具体设计：将两个 rox 位点插入到 CreER cDNA 的雌激素受体编码区两侧，形成可切换的 CreER 重组酶。在理想情况下，Cre-ER 蛋白位于细胞质中，无法入核发挥重组酶活性。将该遗传修饰动物模型与另一个 Marker 基因启动的 Dre 小鼠交配后，Dre 介导 rox 位点之间的重组并将 ER 区去除，此时 Cre 即可正常入核发挥功能。

图6. CrexER小鼠的基因重组图解 [4]

与 roxCre 类似，CrexER 遗传策略同样适用于标记 A⁺B⁺ 细胞。

案例2：精准标记冠状动脉内皮细胞

据报道，间皮细胞标志物 Wt1 在发育中的冠状动脉血管中表达，但在其他血管中不表达，且 Wt1-CreER 小鼠可标记心外膜细胞与胚胎心脏中的冠状动脉内皮细胞。第二个标记物 Tie2 是泛内皮细胞标记物，在大多数血管以及某些髓系细胞群中表达。

研究者关注冠状动脉内皮细胞，因此构建了 Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato 小鼠。

图7. Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato 小鼠的基因重组图解 [4]

利用 CrexER 系统，研究者精准标记到了 Wt1 和 Tie2 双阳性的细胞群。经检测，被标记为红色的细胞群中致密心肌中内皮细胞占比 97.15%±0.61%。

图8. 使用 CrexER 准确标记心肌中内皮细胞 [4]

CDH3 为心肌内皮细胞的另一 Marker。图中红色（CrexER 策略）与绿色（CDH3 标记）信号基本一致。

3. dCreER 遗传策略

基本原理

前两种策略都用于标记 A⁺B⁺ 细胞，而 dCreER 策略则提供了一种标记 A⁺B⁻ 细胞 的方案。

设计思路：将两个 rox 位点插入到 CreER 整体编码区的两侧，使整段 CreER 可以被 Dre 重组酶删除。

当 Dre 酶不存在时：CreER 正常表达，行使功能

当 Dre 酶存在时：CreER 序列被剪切，无法进行表达或翻译

图9. dCreER 小鼠的基因重组图解

因此，dCreER 遗传策略适用于标记 A⁺B⁻ 细胞。

案例3：精准标记白色脂肪组织（WAT）

哺乳动物的脂肪组织有两种类型：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）。目前没有很好的标记 WAT 的 marker，主要方式还是依靠泛脂肪 marker PLIN1，而 BAT 可以使用棕色脂肪组织 marker UCP1 进行标记。

研究者利用 dCreER 遗传策略，构建了 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre;R26-tdTomato 遗传修饰动物模型（下述将 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre 交配小鼠称为 WA-iCre 小鼠）。

图10. WA-iCre;R26-tdTomato 小鼠的基因重组图解 [5]

标记逻辑：

WAT 中：PLIN1 正常表达，UCP1 不表达 → 在 TAM 的作用下，CreER 正常行使功能，细胞被标记为红色

BAT 中：UCP1 表达 → Dre 介导两个 rox 位点发生重组 → PLIN1 之后的 CreER 被去除 → 细胞无法被标记

图11. 使用 dCreER 准确标记 WAT 细胞 [5]

小结

以上三种针对重组酶的改造方案各有侧重：

· roxCre：通过 Stop 序列阻断 Cre 转录，需 Dre 激活后才能发挥功能 → 标记 A⁺B⁺ 细胞

· CrexER：通过 ER 将 Cre 锁在细胞质，需 Dre 去除 ER 后 Cre 才能入核 → 标记 A⁺B⁺ 细胞

· dCreER：整段 CreER 可被 Dre 删除，Dre 存在则 Cre 失活 → 标记 A⁺B⁻ 细胞

经过改造后，一种重组酶的活性可受到另一种重组酶的调控，这种制约关系帮助我们在转基因小鼠中精准地标记目的细胞，有效避免了单一 Marker 异位表达带来的标记不准确问题。

谱系示踪系列课程往期回顾：

【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式

【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法

【谱系示踪系列第三期】多重组酶介导的交叉报告基因方法

谱系示踪的难点——基因标记的异位表达如何避免？（上）

谱系示踪的难点——基因标记的异位表达如何避免？（中）

Reference：

[1] He L, Li Y, Li Y, et al. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498.

[2] Shi Mengyang, Li Jie, Liu Xiuxiu, et al. The robust, high-throughput, and temporally regulated roxCre and loxCre reporting systems for genetic modifications in vivo. eLife. 2024;13:RP97717.

[3] Han, M., Liu, Z., Liu, L. et al. Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis. Nat Genet 55, 665–678 (2023).

[4] Pu W, He L, Han X, et al. Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels. Circ Res. 2018 Jun 22;123(1):86-99.

[5] Han X, Zhang Z, He L, et al. A suite of new Dre recombinase drivers markedly expands the ability to perform intersectional genetic targeting. Cell Stem Cell. 2021 Jun 3;28(6):1160-1176.e7.

[6] Dual recombinase-mediated endothelial cell-specific lineage tracing and ablation. Cell Regen. 2026.

[7] Lineage tracing from cellular heritage to disease destiny. Nat Genet. 2026.

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