J Hepatol | 从表观遗传到免疫枢纽：SETDB1缺失如何为肝癌“搭建”三级淋巴结构？
2026年7月15日，武汉大学生命科学学院吴旻教授、李联运教授团队联合武汉大学中南医院陈明锴教授团队，在肝病学领域顶刊Journal of Hepatology在线发表了题为“Setdb1 represses anti-tumor immunity and tertiary lymphoid structures in hepatocellular carcinoma”的研究论文。该研究发现，表观遗传因子SETDB1是肝癌免疫微环境的关键负调控分子——其缺失可诱导肝癌组织中形成成熟的三级淋巴结构（TLS），通过激活cGAS通路分别上调Cxcl12和Zbp1，促进B细胞募集成熟与肿瘤细胞坏死性凋亡，从而重塑抗肿瘤免疫应答，并与免疫检查点抑制剂协同增效。
南模生物为该研究提供了Setdb1-Flox（目录号：NM-CKO-190052）小鼠模型。
亮点速递
Setdb1缺失可在肝细胞癌中诱导成熟三级淋巴结构（TLS）形成；
Setdb1敲除与免疫治疗协同抑制肝细胞癌进展；
Setdb1缺失通过cGAS通路诱导三级淋巴结构形成；
Cxcl12位于cGAS通路下游，是三级淋巴结构形成的必要条件。
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SETDB1在肝细胞癌中的促癌作用
研究团队首先在Akt/NRAS（G12V）流体动力学肝癌模型中通过CRISPR技术敲低Setdb1，以评估其在肝癌发生发展中的功能。结果显示，Setdb1敲低显著抑制了肿瘤生长，肝脏表面肿瘤结节明显减少，甲胎蛋白（Afp）表达显著下调，小鼠生存期显著延长；同时肝脏脂肪变性减轻，组织正常结构得以恢复（图1B-F）。在Setdb1肝脏条件性敲除（Setdb1 CKO）小鼠中，同样观察到了肝癌发生的显著抑制（图1G-H）。TCGA数据库分析进一步表明，SETDB1在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，且其高表达与患者预后不良密切相关。综合上述证据，SETDB1在肝细胞癌中发挥明确的促癌作用，是肝癌发生发展的重要驱动因子之一。
图1. Setdb1缺失抑制Akt/NRAS驱动的肝细胞癌
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Setdb1缺失激活免疫球蛋白
表达并形成TLS样结构
为探究SETDB1调控肝癌免疫微环境的分子机制，研究团队对对照组和sgSetdb1组的肿瘤组织进行了转录组测序。分析结果出人意料：sgSetdb1组中大量免疫球蛋白相关基因显著上调，基因集富集分析（GSEA）同样证实免疫球蛋白生成通路在Setdb1敲低样本中显著富集（图2A-B）。RT-PCR和ELISA分别在mRNA和蛋白水平上验证了IgG表达的上调（图2C-D）。这一现象提示，Setdb1缺失可能触发了B细胞介导的体液免疫应答，而B细胞在TLS中分化为浆细胞并产生抗体是TLS成熟的重要标志。
鉴于IgG的产生通常反映B细胞向浆细胞的分化成熟，研究团队通过CIBERSORT算法对免疫细胞浸润进行了评估，结果显示Setdb1缺失的肝脏中浆细胞和树突状细胞比例显著增加（图2E）。组织学分析发现，Setdb1敲低样本中免疫细胞常聚集于特定区域（图2F），免疫荧光染色证实这些聚集灶富含IgG⁺浆细胞、CD20⁺B细胞和CD3⁺T细胞（图2G）。功能实验进一步表明，从Setdb1敲除小鼠分离的血清在体外可识别Hepa1-6细胞，并在体内抑制肿瘤生长，提示这些TLS样结构具有抗肿瘤免疫功能。由此可见，Setdb1缺失组织中已形成具有功能的TLS样结构，且这些结构能够产生具有抗肿瘤活性的抗体。
图2. Setdb1缺失激活免疫球蛋白转录程序
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空间转录组学验证
Setdb1缺失诱导的TLS形成
为获得TLS形成的直接空间证据，研究团队对Akt/NRAS模型肝脏进行了单细胞空间转录组分析。利用已报道的TLS标志基因及研究团队自定的基因集，均在sgSetdb1组织中检测到明确的TLS区域（图3A-B）。细胞群体注释显示，sgSetdb1组织中恶性细胞比例显著减少（图3C-D）。空间定位分析进一步揭示，B细胞与树突状细胞位于TLS中央区域，而T细胞与髓系细胞分布于外层，这一空间构象与经典TLS结构高度一致，表明Setdb1缺失所诱导的TLS在组织结构上具备成熟特征。
研究团队进一步在临床样本中验证了上述发现。在肝癌患者标本中，SETDB1低表达者的TLS相关基因特征评分更高；免疫组化染色证实，TLS阳性组中SETDB1的表达水平显著低于TLS阴性组（图3E）。此外，在皮下Hepa1-6模型中，Setdb1敲除与抗PD-L1抗体联合治疗可进一步缩小肿瘤体积，且在联合治疗组小鼠的肿瘤边缘出现了明显的B细胞和T细胞聚集灶（图3F-I）。上述结果表明，SETDB1表达与TLS形成呈负相关，Setdb1缺失足以在肝癌中诱导成熟TLS的产生，并与免疫检查点抑制剂表现出协同增效作用。
图3. Setdb1缺失在肝癌中诱导TLS形成
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Setdb1缺陷肝细胞中cGAS通路
的激活及坏死性凋亡的诱导
研究团队发现，Setdb1敲除的Hepa1-6细胞胞质中出现明显的双链DNA（dsDNA）积聚（图4A）。已知胞质dsDNA可激活cGAS-STING先天免疫通路。RT-PCR结果显示，Setdb1敲除显著增强了由DNA病毒HSV-1或合成dsDNA（ISD）诱导的Il6、Ifnb和Isg15表达，而敲低Sting1可完全阻断这一增强效应（图4B-D），表明该过程严格依赖于cGAS通路。
Zbp1是I型干扰素下游的促坏死性凋亡基因。研究团队发现，Setdb1缺失可显著上调Zbp1的mRNA和蛋白水平（图4E），且TLS区域内磷酸化MLKL水平明显升高（图4F），提示TLS内部发生了Zbp1介导的坏死性凋亡。这一过程可能通过释放肿瘤源性抗原，为TLS中B细胞的激活提供必要的免疫刺激信号。坏死性凋亡作为一种免疫原性细胞死亡方式，其释放的损伤相关分子模式和肿瘤抗原可被树突状细胞捕获并呈递给T细胞，进而启动适应性免疫应答。
值得注意的是，TLS的形成还依赖于特定的组织微环境。在皮下荷瘤模型中，Setdb1敲除虽可抑制肿瘤生长，但并未观察到TLS的形成；而当同样来源的Hepa1-6细胞被原位注射至小鼠肝脏后，Setdb1敲除成功诱导了TLS形成。此外，在c-Myc/β-catenin驱动的HCC模型中，Setdb1敲除同样无法诱导TLS，提示肿瘤分子亚型也是决定TLS能否形成的关键因素。综上，Setdb1缺失通过产生胞质dsDNA激活cGAS通路，进而上调Zbp1并在TLS中诱导坏死性凋亡；同时，肝脏微环境和肿瘤分子亚型对TLS的诱导也具有重要调控作用。
图4. Setdb1缺失诱导的胞质DNA激活cGAS通路
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cGAS通路介导B细胞
成熟相关趋化因子的表达
生发中心中，趋化因子Cxcl12/Cxcl13及其受体Cxcr4/Cxcr5对B细胞的招募和成熟至关重要。研究团队发现，HSV-1感染可显著激活Hepa1-6和AML12细胞中Cxcl12和Cxcr5的表达，而Setdb1缺失进一步增强这一效应（图5A-B）。值得注意的是，RNA病毒SeV虽可激活Ifnb和Il6，却无法诱导Cxcl12表达，提示Cxcl12的上调特异性地依赖于DNA介导的cGAS通路。使用STING抑制剂H151或TBK1抑制剂MRT67307均可阻断Setdb1缺失增强的Cxcl12表达（图5D）。在Hepa1-6细胞中敲低Sting1同样消除了Setdb1缺失对Cxcl12和Cxcr5的上调效应（图5C）。这一系列体外实验从多个层面交叉验证了cGAS通路在趋化因子诱导中的核心地位。
图5. Setdb1缺失诱导的Cxcl12表达依赖于cGAS通路
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CXCL12在体内参与TLS形成
在动物模型中，Setdb1敲低可显著上调肝癌组织中Cxcl12和Cxcr5的表达，而Cxcl13和Cxcr4则无明显变化（图5E）。单细胞空间转录组分析进一步显示，Cxcl12主要在胆管细胞、成纤维细胞、中央区及门静脉周围肝细胞和恶性细胞中上调（图5F）。Cxcl12在中央区及门静脉周围肝细胞中的上调尤其值得关注，这些区域靠近TLS形成的部位，提示Cxcl12的局部浓度梯度可能直接引导B细胞的定向迁移。
更为重要的是，Setdb1缺失后Cxcl12阳性中央区/门静脉周围肝细胞与B细胞的空间距离显著缩短（图5G），直接支持了Cxcl12在B细胞招募中的关键作用。研究团队进一步在Akt/NRAS模型中同时敲低Sting1和Setdb1，发现TLS数量大幅减少（图5H）。在Hepa1-6原位模型中敲除Cxcl12同样消除了Setdb1缺失诱导的TLS中的B细胞信号，伴随肿瘤体积增大和IgG表达下调（图5I-J）。以上结果证实，Cxcl12位于cGAS通路下游，是Setdb1缺失诱导TLS形成所必需的关键趋化因子。
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Setdb1缺失激活ERVs表达
并与免疫球蛋白空间共定位
Setdb1作为异染色质区域H3K9me3修饰的关键甲基转移酶，已知其缺失可解除对内源性逆转录病毒（ERVs）的转录抑制。研究团队对Akt/NRAS模型的转录组数据进行分析，发现Setdb1敲低使54种逆转录转座子表达上调，其中绝大多数为ERVs（图6A）。RT-PCR验证了多个代表性ERVs（包括RLTR6-int、RLTR6B-Mm和MMERVK10C-int）的表达上调（图6B）。在部分上调ERVs的基因组位点上，研究团队并未观察到H3K9me3的显著降低，反而检测到H3K27ac水平升高（图6C-D），提示Setdb1对ERV的调控机制可能比既往认知更为复杂。
单细胞分析显示，ERVs的上调主要发生于恶性细胞、胆管细胞及中央区/门静脉周围肝细胞中（图6E）。空间定位分析表明，表达ERVs的恶性细胞在sgSetdb1组织中倾向于富集于TLS区域附近，而在对照组中呈随机分布（图6F）。最为关键的发现来自免疫球蛋白与ERVs的空间共定位分析：免疫球蛋白基因模块评分与ERVs（如RLTR6-int、RLTR6B-Mm）的表达在空间上高度邻近，两者在TLS区域内呈现出明显的共富集趋势（图6G）。这些发现提示，Setdb1缺失激活的ERVs可能作为肿瘤特异性新抗原，在TLS中刺激B细胞成熟并促进抗体的产生。这一发现将表观遗传调控、内源性逆转录病毒去抑制与抗肿瘤体液免疫应答三者有机联系起来，为理解TLS形成的分子基础提供了全新视角。
图6. ERV表达与免疫球蛋白产生相关
综上所述，这项研究揭示了表观遗传因子SETDB1作为肝癌免疫微环境关键负调控分子的全新功能：SETDB1通过维持H3K9me3修饰依赖性异染色质沉默，抑制ERVs表达和cGAS-STING通路的激活，从而阻止TLS的形成；而SETDB1缺失可释放这一“表观刹车”，一方面通过cGAS-Cxcl12轴促进B细胞的招募与成熟，另一方面通过cGAS-Zbp1轴诱导肿瘤细胞坏死性凋亡并释放抗原，两条路径协同作用，在肝癌组织中构筑起成熟的三级淋巴结构，重塑抗肿瘤免疫应答。
SETDB1兼具促癌与免疫抑制双重功能，使其成为一个极具吸引力的药物干预靶点。该研究还证实SETDB1缺失与免疫检查点抑制剂具有协同增效作用，提示靶向SETDB1的RNAi疗法或小分子抑制剂联合PD-1/PD-L1阻断抗体，有望为肝癌免疫治疗提供全新的增敏策略。这一发现为理解表观遗传调控、先天免疫识别与适应性抗肿瘤免疫应答之间的交叉调控提供了新的理论框架，也为肝癌的联合免疫治疗开辟了新的方向。
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