基因编辑技术

基因编辑技术有哪些?CRISPR/Cas9基因编辑技术有哪些优势?什么叫ES细胞打靶(ESC打靶)?

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为了使我们的客户获得理想的动物模型,符合他们从基础科研到药物研发的研究需求,南模生物始终专注于模式生物的基因编辑与模型研发,拥有专业的项目设计团队与人工智能自动化分析系统SmartEddi,以及经验丰富、受过严格专业培训的实验技术队伍,自2000年以来建立了稳定而高效的基因工程小鼠研发服务平台,致力于提供最高标准的基因修饰动物模型解决方案。


我们使用以下三种基因修饰技术构建基因工程小鼠模型:

三种基因修饰技术的比较

核心技术类型
技术要点 周期 技术应用 优缺点
CRISPR/Cas9技术 Cas9 核酸酶剪切特定靶点 6–9 个月 基因敲除、条件性基因敲除、基因定点插入、点突变、基因人源化 技术周期短、效率高;有潜在脱靶风险,但风险可控(选择合适的sgRNA   可有效降低脱靶风险;通过测序可确定是否脱靶;传代可去除脱靶位点)
ESC 打靶 同源重组对靶基因进行修饰 9–12 个月 基因敲除、条件性基因敲除、基因定点插入、点突变、基因人源化 技术成熟、效果稳定、无脱靶,可实现大片段重组;实验周期较长

Piggybac转基因技术

转座酶将片段整合到基因组 3–6 个月 基因过表达 单拷贝插入,表达阳性率高;多位点插入,后续实验需建系




ES细胞打靶

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在小鼠ES细胞中,利用同源重组原理(也就是核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间交换的基因重组),获得带有研究者预先设计的遗传修饰的中靶ES细胞。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性,可以发育为嵌合体动物的生殖细胞,使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传,最终获得基因修饰小鼠模型。发展至今,仍是最为经典、可靠的小鼠基因修饰或编辑技术。


目前南模生物可提供3种遗传背景的小鼠ES细胞:C57BL/6,129/S6,B6;129。

可用于获得以下类型小鼠模型:

  • 基因敲除

  • 条件性基因敲除

  • KO first

  • 基因敲入

  • 点突变

  • 条件性点突变

  • 定点基因过表达

  • 人源化


南模生物会对每个项目进行分析与评估,综合时间与风险因素从而选用最合适的技术(ES细胞打靶或CRISPR基因编辑)。


联系我们,与南模生物的技术顾问讨论如何应用ES细胞打靶技术获得您的动物模型吧!


利用ES细胞打靶技术获得小鼠模型的一般流程

  1. 设计并构建同源重组载体

  2. 将同源重组载体转入小鼠ES细胞中

  3. 筛选并验证中靶的阳性ES细胞克隆

  4. 将阳性ES细胞注射到小鼠囊胚腔中

  5. 将注射后的小鼠囊胚移植到假孕母鼠子宫内

  6. 获得并筛选验证阳性嵌合体小鼠F0

  7. 阳性F0通过与野生型小鼠或FLP小鼠交配获得F1代杂合子小鼠




CRISPR基因编辑

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CRISPR / Cas9核酸酶系统需要两个组分:用于切割靶序列的Cas酶和与20个碱基对(bp)的靶序列结合指导RNA(sgRNA)。利用靶点特异性的sgRNA 指导 Cas9 核酸酶在基因组上的特定靶点进行DNA双链剪切。通过非同源末端连接(NHEJ)可导致移码突变,实现基因敲除(KO) ;通过同源重组修复(HR)可将外源片段整合到基因组指定位点(KI)。


CRISPR基因编辑技术的优势

  • 与传统的基因打靶方法相比,大大缩短了研发周期。

  • 打破对小鼠遗传品系的限制,实现不同遗传背景或在已有基因修饰小鼠模型基础上的基因编辑。

  • 降低基因敲除、敲入小鼠模型的定制成本。


南模生物使用最新的CRISPR / Cas9基因编辑技术为您定制属于您的基因工程小鼠模型。

我们会对每个项目进行分析与评估,综合时间与风险因素从而选用最合适的技术(CRISPR基因编辑或ES细胞打靶)。


联系我们,与南模生物的技术顾问讨论如何应用CRISPR技术获得您的动物模型吧!


利用CRISPR基因编辑技术获得小鼠模型的一般流程

  1. 选择靶位点并设计sgRNA,设计同源重组载体(可选)

  2. 制备sgRNA和Cas9 mRNA,构建同源重组载体(可选)

  3. 将sgRNA和Cas9mRNA(以及同源重组载体(可选))注入小鼠受精卵中

  4. 注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管

  5. 获得并筛选验证阳性F0代小鼠

  6. 阳性F0通过与野生型小鼠交配获得F1代杂合子小鼠



 

转基因技术

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通过原核显微注射,将设计好的基因(或多基因)注射并随机整合到小鼠基因组中,获得随机插入的转基因小鼠。也可以利用高效转座子piggyBac系统,更高效地获得转基因小鼠模型。


联系我们,与南模生物的技术顾问讨论如何获得您的转基因动物模型吧!


获得随机转基因小鼠模型的一般流程

  1. 设计并构建转基因质粒

  2. 将线性化的转基因质粒片段注射到小鼠受精卵中

  3. 注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管

  4. 获得并筛选验证阳性F0代小鼠


利用高效转座子系统获得转基因小鼠模型的一般流程

  1. 设计并构建piggyBac转座子质粒

  2. 将转座子质粒与piggyBac转座酶共同注射到小鼠受精卵中

  3. 注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管

  4. 获得并筛选验证阳性F0代小鼠





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