2月26日，国际学术期刊 Science 以 Research Article形式在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组的研究成果“Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair”。

南模生物为该研究构建了关键的Ki67-CreXER2小鼠模型。

该研究首次开发了能够长时程示踪体内细胞增殖的新技术，利用该技术研究人员发现了成体肝细胞的来源，为肝脏再生及疾病临床治疗研究提供了新思路。

Fig.1 Generation and characterization of Ki67-CrexER mice. A. Schematic showing ProTracer strategy. B. Schematic showing a Ki67 fate map.

周斌研究组利用ProTracer研究了在成体肝脏生理稳态和损伤再生过程中肝细胞的来源。

目前，在肝脏领域，这是一个亟待解决且具有争议的重要科学问题。尽管在某些极其严重的肝损伤情况下，胆管细胞可以转分化贡献形成肝细胞，但是在肝脏生理稳态和损伤再生过程中的肝细胞的更新主要依赖原有肝细胞的自我增殖。肝脏的基本结构单位是肝小叶，肝小叶中的肝细胞由于代谢功能和基因表达等的不同具有较大的异质性，从肝门静脉区到肝中央静脉区大体可分为三区：门静脉周围肝细胞（E-CAD+，Zone 1）、中间区肝细胞（E-CAD–GS–，Zone 2）和中央静脉周围肝细胞（GS+，Zone 3）。

有研究认为不同区域的肝细胞增殖能力显著不同, 但究竟哪些肝细胞亚群对新生肝细胞起主要贡献仍存在较大争议，目前主要有以下几种理论：

Fig.2 Schematic showing three liver zones from the periportal to the pericentral region. Lower panel shows immunostaining for glutamine synthetase (GS) and E-cadherin (E-CAD). 1, 2, and 3 indicate zone 1 (E-CAD+), zone 2 (E-CAD-GS-), and zone 3 (GS+), respectively. Dashed arrow indicates blood flow.

周斌研究组突破以往的研究模式，即不再依赖单一分子标记追踪某一肝细胞亚群的扩增情况，而是利用ProTracer技术去直接标记新生的肝细胞，不仅可以实现对所有肝细胞类群进行分析，还可以直观精准地展现出新生肝细胞的来源。研究人员首先采用广谱性的ProTracer（所有类型细胞的增殖都能够被检测）在成体启动细胞增殖的记录，并在启动后的多个不同时间点检测肝细胞的增殖信号，结合E-CAD和GS等肝细胞分区标记基因免疫荧光共染色，发现在生理稳态过程中肝细胞通过缓慢的增殖维持自我更新。意外的是，新生的肝细胞并非来源于以往报道的任何一个类群，而是主要来源于肝小叶中的中间区域（E-CAD–GS–，Zone 2）。

Fig.3 ProTracer reveals highly regional hepatocyte proliferation in the liver lobule. A. Schematic showing the experimental strategy using ProTracer (R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-GFP). B. Immunostaining for GFP, GS, and E-CAD on liver sections at baseline (day 0) and day 2 after Tam treatment. Arrowhead indicates GFP+ hepatocyte. C. Immunostaining for GFP, GS, E-AD, and b-catenin on liver sections collected at weeks 2, 4, 6, 8, 10, and 12 after Tam treatment. D. Quantification of the percentage hepatocytes (Hep) expressing GFP in each zone of the liver lobule.

将肝细胞特异性ProTracer在成体启动后，研究人员将肝脏的全标本进行了荧光拍照，发现被tdTomato红色荧光标记的增殖的肝细胞呈现出一圈圈类似“甜甜圈”的形状（图A），说明肝细胞增殖具有区域偏好性，肝脏组织切片的免疫荧光染色结果进一步证实了增殖的肝细胞位于肝小叶的中间区域，即E-CAD–GS–的Zone 2（图B）。此外，周斌组还开发了活体检测肝细胞增殖的ProTracer技术，利用该技术他们检测了同一个小鼠个体在多个不同时间点肝细胞的增殖及其动态变化过程，这也是世界上首次实现活体检测细胞增殖。

Fig.5 A.利用肝细胞特异性的ProTracer标记增殖肝细胞的成体小鼠肝脏。tdTomato+的增殖肝细胞呈现出一圈圈的类似“甜甜圈”的形状。B.利用ProTracer揭示成体肝脏中新生肝细胞（tdTomato+）主要来源于E-CAD–GS– Zone 2。E-CAD（绿色）；GS（青色）。

为了研究肝脏损伤再生过程中新生肝细胞的来源，研究人员利用ProTracer技术结合肝切、胆管结扎和CCl4等多种肝损伤模型，发现在肝切模型中，位于Zone 1的肝细胞起始肝脏再生过程，然后Zone 2 的肝细胞迅速增殖。而在胆管结扎和CCl4急性损伤模型中，则是位于Zone 2的肝细胞起始肝脏再生过程。此外，研究人员利用广谱性ProTracer系统地描绘了肝脏再生过程中其他类型细胞的增殖情况，如胆管上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞。

综上，该研究的亮点在于开发了一种检测细胞增殖的遗传新技术——ProTracer，以全新的视角研究了成体肝细胞的来源，突破了传统思维模式和技术局限性，直观地展现了所有肝细胞类群的增殖情况，首次发现肝小叶中间区域（Zone 2）的肝细胞是成体肝脏在生理稳态中新生肝细胞的主要细胞来源，同时揭示了不同损伤再生模型中新生肝细胞的来源，准确回答了成体肝细胞来源这一重要科学问题。该研究为肝脏损伤修复再生研究开辟了新思路，为肝脏疾病的治疗提供了新的理论基础。

此外，新开发的ProTracer技术具有长时间不间断检测细胞增殖的能力，可以特异性地标记某种特定细胞谱系的细胞增殖，并且实现了不牺牲样品直接活体检测细胞增殖，从多个维度刷新了细胞增殖检测的能力和范围，可以广泛应用于不同组织器官细胞增殖的检测，为发育生物学、肿瘤学、神经科学和再生医学等众多领域的研究提供强大技术支撑。