小鼠受精卵（早期胚胎）采集在基因工程小鼠的制备和保种中都是非常重要的步骤。只有采集到足够数量和质量的受精卵，才能更有效地进行显微注射、胚胎移植或冻存复苏，保证获得高质量的子代小鼠。

那么受精卵到底是怎么采集的呢？今天我们就来介绍一下1细胞期与2细胞期胚胎的收集方法。

哺乳动物的受精过程发生在输卵管内，小鼠胚胎进入子宫着床时间大约为4天左右。因此，需要在配种后或受精后的适当时间从超排供体收集不同时期的胚胎。

小鼠受精后4.5天内早期胚胎发育的过程：

人、小鼠、大鼠胚胎发育阶段对应时间点：

受精卵获得的方法分自然排卵、激素诱发排卵和体外受精三种方法。我们今天介绍的是诱发排卵（超排）后采集受精卵的方法。

诱发排卵（超排）后采集受精卵的方法

雌鼠超排与合笼

超排

不同背景的小鼠超排周龄都是不同的，剂量也是不同的。那以常用的C57小鼠为例，超排周龄为3-4周龄。当达到超排周龄后，向雌小鼠腹腔内注射5个国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)，然后约46-48h后再注射5 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12h后即可诱发排卵。

合笼

1） 雌小鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼。雄鼠交配一般是在夜晚发生，交配过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。

2） 交配后过夜易见小鼠的阴道栓。

1-cell期胚胎采集

输卵管切开

1） 通过断颈快速处死见栓0.5天的小鼠。

2） 将小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。

3） 用眼科镊捏紧正中线皮肤，用外科剪剪出一个横切口，钝性分离皮肤与肌肉，充分暴露背侧腰部肌肉。

4） 卵巢位于脊柱两侧隐约可见的白色脂肪团的下方，用眼科镊拎起脂肪团上腹膜，眼科剪在此处开一小口，用镊子夹住脂肪垫，轻轻地将子宫、输卵管、卵巢拉出体腔。

5） 用眼科镊将输卵管、卵巢和脂肪团拉伸，用眼科剪在输卵管和卵巢之间剪开，重新定位眼科镊的位置，然后在靠近输卵管的子宫部剪开，将断离的输卵管放入预先准备好的小玻璃皿中的 M2 液滴中。对另一侧输卵管重复上面操作。

离体输卵管内受精卵的收集与处理

1） 用眼科镊撕开输卵管膨大的壶腹部，即看到包绕受精卵的丘细胞团。游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤压输卵管将受精卵推出裂口。

2） 全部卵群取出后，将其转移到一个约 200ul 的液滴中，加入 10-15ul 的 500U/ml 透明质酸酶（hyaluronidase）消化颗粒细胞，约30秒-1分钟，必要时用毛细管吹打卵群数次。如颗粒细胞全部脱落，则开始清洗步骤；如仍有部分未脱落则再等待数十秒直到全部脱落。

3） 洗涤：用玻璃细管（直径约120um-250um，即大于一个受精卵的直径而小于二个受精卵的直径）把受精卵在新的 M2 液滴中转移五次，洗去颗粒细胞、残渣及透明质酸酶，将洗好的受精卵转移到覆盖有矿物油（可防止污染同时防止培养基水分蒸发影响pH）的 M16 液滴（在 5%CO2、37℃培养箱中平衡过夜，保证正确 pH 值）中，再放入 5%CO2、37℃培养箱中备用。

2-cell期胚胎采集的时间

与1-cell期胚胎的采集不同之处在于：

1） 使用见栓1.5天的供体雌鼠。

2） 将断离的输卵管放入预先准备好的小玻璃皿中的 M2 液滴中后，使用吸有 M2 的注射器配钝口的4#针头，插入输卵管，仅冲洗输卵管部分，收集胚胎。并将胚胎洗涤干净，洗去血细胞及残渣等，将洗好的胚胎转移到覆盖有矿物油的 M16 液滴中，再放入 5%CO2、37℃ 培养箱备用。

M2 和 M16培养基

M2与M16都是化学成份明确的培养基（chemically defined medium；CDM）。CDM含胚胎需要、能维持和胚胎生长发育，分裂繁殖的化学成分：多种盐离子、能量物质、生长因子、动物白蛋白或含蛋白等大分子的各种动物血清。

标准的M16在上世纪70年代初定型，现已商业化，是世界各地实验室仍常用于小鼠胚胎实验的一种CDM。M2是在M16基础上添加了HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。利用HEPES可适当延长培养基和其中培养物在自然环境下(二氧化碳培养箱外)的使用时间。因其可较长时间维持一定的pH平衡，便于自然环境下操作应用。M2更适于小鼠等动物在采集卵母细胞，或胚胎在相对较长时间的体外操作等环节应用。