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紧随指南—脑科学研究动物模型汇总


9月16日,国家科技部发布了《科技创新2030—“脑科学与类脑研究”重大项目2021年度项目申报指南》。该项目围绕脑认知原理解析、认知障碍相关重大脑疾病发病机理与干预技术、类脑计算与脑机智能技术及应用、儿童青少年脑智发育和技术平台建设5个方面,共部署指南方向59个,国拨经费概算31.48亿元。

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( 图片来自网络)

“脑科学与类脑研究”2021重大项目明确指出需要利用模式动物研究神经细胞的起源、分化与老化进程,突触和神经环路形成的机理研究,胶质细胞在神经系统功能中的作用,抑郁症、阿尔兹海默症的发病机制研究等问题。这些基础研究主要集中在2个方向,一是研究脑功能的细胞和分子机理,一是研究脑重大疾病的发生发展机理。


脑功能的细胞和分子机理

大脑是人体当中发育最早、成熟最晚的器官,也是人体当中最复杂的器官。大脑由神经管的一端发育而成,小儿刚出生时,脑的重量仅有350-400克,大约是成人脑重的25%,到2岁时即达到成人脑重的75%,随后继续缓慢增长。大脑发育的另一个重点在于精简神经连接,在我们生命的头15个月左右,神经元之间的神经突触连接数量就达到最大了,再接着大脑开始大幅修剪这些错综复杂的神经连接,直到青春期结束。

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图2. 大脑发育过程


大脑的细胞分型 

神经元多样性的起源问题是研究大脑发育的核心问题,大脑中主要的细胞类型有神经母细胞、神经元、胶质细胞、成胶质细胞、免疫细胞、成纤维细胞等。经过多年的研究,科学家们已经搞清楚了这些细胞的主要标志物[2],如脑室区祖细胞标志物Emx2、Sox6等,室下区祖细胞标志物Tbr2,Cux2等。但是哺乳动物的大脑是相当复杂的,粗略估计有一千多种不同的细胞类型,传统的研究方法很难将大脑的细胞类型全部搞清楚。随着单细胞测序技术的发展,让我们细分这千余种细胞成为了可能。

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图3.  胚胎发育期小鼠大脑的标志物


胚胎期大脑

近日,瑞典科学家在Nature发表题为“Molecular architecture of the developing mouse brain”的文章,对发育过程中小鼠大脑的不同细胞进行了详尽的分类。作者共观察到了87种神经胶质细胞亚型、171种神经节母细胞亚型和306种神经元亚型[3]。小鼠大脑发育过程转录组图谱的构建有利于对哺乳动物神经系统发展进行研究。

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图4. 发育中的小鼠大脑图谱


成年大脑

同样的,利用单细胞测序技术,成年小鼠大脑的细胞分型工作已经完成了,相关研究结果同样发表在Nature上。依据神经元、星形胶质细胞、室管膜细胞、少突胶质细胞、免疫细胞等大类同样可以将成年小鼠大脑细分出几百种细胞类型[5]。值得一提的是,作者发现了七种不同的、受区域限制的星形胶质细胞。这些细胞分类的研究结果为后续深入探究基因功能或疾病机理打下了坚实的基础。

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图5. 成年小鼠大脑的细胞分型


常用研究模型

大脑的细胞分型是深入研究其分子机理的基础,但我们还需要可靠的模型来完成这些研究。例如小鼠大脑皮层负责控制身体灵活性和平衡的GABA能神经元,鉴定出它在胚胎发育和出生后不同的特异性标志物[6],构建这些标志物启动的Cre工具鼠,如Gad2-Ires-Cre;Sst-Ires-Cre等,将它们与带有荧光标签(EGFP、Tdtomato等)或目的基因的flox小鼠配合使用,就可以在细胞层面和分子层面深入研究GABA能神经元的功能。

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图6. GABA能神经元基因靶向的总体方案


南模生物在小鼠大脑细胞特定标记基因中敲入Cre/Dre重组酶元件,研究者可以对每类细胞进行定义、标记及区分;或在特定神经细胞中进行精确的基因及细胞功能研究。各类神经细胞研究工具小鼠模型信息见下表:

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注:绿色为已有验证数据的品系(验证数据见南模官网)


神经环路 

人脑包含大约1000亿个神经元,通过前文的简单介绍我们知道这些神经元有着许多不同的类型,那么单个的神经元是如何实现大脑复杂精妙的功能的呢?回答这个问题需要引入一个概念——神经环路。神经环路是脑内不同性质和功能的神经元通过各种形式形成的复杂连接。

本月,Science杂志重磅推出了顶级神经科学家骆利群院士的综述文章:Architectures of neuronal circuits。骆利群院士把神经元比喻为字母,微环路比喻为单词,神经环路比喻为句子,大脑比喻为整篇文章[7]。当今,对神经系统的研究主要也是以神经环路为基础的,因为大脑发出的指令往往是一句话,而不是一个单词或者一个字母。我们的喜怒哀乐,学习记忆等行为都是架构在一个个神经环路之上的。

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图7. 神经环路调节的原理


光遗传学

光遗传学是研究神经环路的一个新兴手段,它整合了光学、软件控制、基因操作技术、电生理等多学科交叉的生物工程技术。其主要原理是首先采用基因操作技术将光感基因(如ChR2、eBR、NaHR3.0、Arch或OptoXR等)转入到神经系统特定类型的细胞中进行特殊离子通道或GPCR的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性,从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化,达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的[10]。

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图8. 常用光感基因

ChR2是一个常用的光感基因,研究发现将其第134位氨基酸组胺酸突变为精胺酸,得到的ChR2-H134R在受到蓝光照射时可以产生两倍的光电流,通道开关速度比野生的ChR2慢了一倍,ChR2-H134R更适合用于光遗传的研究中。

 

化学遗传学

与光遗传学一样,化学遗传学在神经环路研究中的应用也十分广泛。化学遗传学是利用生物活性小分子与蛋白相互作用研究生物学系统功能的一种方法。在化学遗传学中,DREADDs被用来激活或抑制目标神经元。DREADDs是一种基于G蛋白偶联受体所改造的化学遗传学平台,通过将不同的G蛋白偶联受体进行改造,修改后的受体只能由人工合成的特殊化合物来激活或者抑制,并激活相应的GPCR信号通路,从而引发细胞不同的兴奋性变化[11]。

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图9. hM3Dq 和hM4Di 的DREADD结构和G蛋白偶联特性


hM3Dq和hM4Di是2种常用的DREADD。Gq偶联的DREADD hM3Dq是一个修饰的人M3毒蕈碱受体,对天然配体乙酰胆碱亲和力低,但对合成配体氯氮平N氧化物(CNO)亲和力高。在CNO刺激下,hM3Dq起到激发神经元的作用。Gi偶联的hM4Di DREADD常被用来沉默靶向神经元,在CNO刺激下,hM4Di则导致神经元的抑制。

 

常用研究模型

南模生物在R26位点上敲入ChR2-H134R、hM4Di、hM3Dq等元件,构建了可用于光遗传或化学遗传研究的工具鼠。详细模型信息见下表:

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重大脑病简介

据世界卫生组织定量评价,全球各类疾病给社会造成的负担中,脑疾病占28%,已超过心血管疾病或癌症。其中备受关注的脑疾病包括自闭症、抑郁症、神经退行性疾病、帕金森等,目前我们对这些重大脑疾病的病因仍不了解,治疗的措施也十分缺乏。科学家们需要继续探索这些重大脑病的致病机理,并开发相应的药物。机理研究和新药物的研发均需要合适的动物模型,因此,建立可用于脑重大脑病的模式动物是不可或缺的一环[1]。

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( 图片来自网络)


自闭症

自闭症,又称孤独症主要表现为人际交往、 情感、语言交流等方面的障碍,以及狭隘的兴趣和重复刻板等怪异行为。我国0—6岁低龄儿童占人口总数近 8%,自闭症的发病率很高,一般平均在1%左右。根据局部抽样调查数据保守推算,我国患儿人数已过百万,受自闭症困扰的人群可能达千万。

Cntnap2基因敲除小鼠是研究自闭症常用的动物模型,CNTNAP2基因位于7号染色体上, 编码CASPR2蛋白,该蛋白主要以细胞粘附分子和受体的形式在脊椎动物的神经系统中发挥功能。Cntnap2-KO小鼠表现出社交互动减少,重复行为增多,以及青少年的超声波发声减少等自闭症样行为[8]。

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图10. Cntnap2-KO小鼠自闭症表型 

除此之外,Mecp2-KO,Nlgn3-KO,Nlgn-R451C等小鼠也是研究自闭症常用的模型。

 

抑郁症

精神疾病是由神经系统病变导致的行为和心理活动紊乱,表现为认知、情感、意志等精神活动出现不同程度的障碍。其中抑郁症最为普遍,据中国疾病预防控制中心调查,我国抑郁症的发病率超过4%,患者人数超过3000 万,已成为影响我国人民生产生活的主要病症之一。

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( 图片来自网络)

社会压力等环境因素是抑郁的重要危险因素,通常被用来诱发啮齿类动物的抑郁样行为,但这种方法具有许多缺点:第一,缺乏特异性,使动物更容易陷入焦虑症,而不是因其本身而导致抑郁。第二,与生物危险因素相比,抑郁症中环境危险因素的相关性被高估了。第三,在动物中评价情绪、内疚、自杀意念等抑郁症核心情绪症状是不可行的[9]。这些都限制了抑郁症动物模型的应用,无法真正的了解抑郁症的发病机制,也就限制了抗抑郁药物的研发。时至今日,建立合适的抑郁症模型依然任重道远。


老年痴呆

神经退行性疾病是一类以神经元的结构和功能逐渐丧失以至死亡为特征的神经系统病变。其中常见的是阿尔茨海默综合征,在65岁及以上的人群中发病率约13%,并且发病率随着年龄的增长而大幅提高。85岁及以上的人群,约有一半以上患有此病。2014年我国老龄人口已突破2亿大关,并且将以每年100万的速度增长。我国属老年痴呆症的高发地区,目前患者人数超过600万,居全球首位,且呈明显上升趋势。

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( 图片来自网络)

 

重大脑病动物模型

南模生物自主构建了多种基因修饰小鼠,可用于阿尔兹海默病(AD)、帕金森(PD)、自闭症(ASD)等重大脑病的研究。模型详细信息见下表:

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南模生物深耕基因编辑领域,提供全方位模式生物服务,包括基因修饰成品模型供应、个性化模型定制、饲养繁育、表型分析、药效评价等,满足不同实验室需求。


Reference:

1. 蒲慕明, 徐波, 谭铁牛. 脑科学与类脑研究概述[J]. 中国科学院院刊, 2016, 31(7): 725-736

2. Biomed Res Int . 2015;2015:727542. doi: 10.1155/2015/727542. Epub 2015 Sep 1. Molecular Biomarkers for Embryonic and Adult Neural Stem Cell and Neurogenesis

3. Nature . 2021 Aug;596(7870):92-96. doi: 10.1038/s41586-021-03775-x. Epub 2021 Jul 28. Molecular architecture of the developing mouse brain

4. https://directorsblog.nih.gov/2018/01/25/snapshots-of-life-the-birth-of-new-neurons/

5. Cell . 2018 Aug 9;174(4):999-1014.e22. doi: 10.1016/j.cell.2018.06.021. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System

6. Neuron . 2011 Sep 22;71(6):995-1013. doi: 10.1016/j.neuron.2011.07.026. Epub 2011 Sep 21. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex

7. Science . 2021 Sep 3;373(6559):eabg7285. doi: 10.1126/science.abg7285. Epub 2021 Sep 3. Architectures of neuronal circuits

8. Kazdoba TM, Leach PT, Crawley JN. Behavioral phenotypes of genetic mouse models of autism. Genes Brain Behav. 2016;15(1):7-26. doi:10.1111/gbb.12256

9. Nat Rev Neurosci . 2019 Nov;20(11):686-701. doi: 10.1038/s41583-019-0221-6. Epub 2019 Oct 2. The future of rodent models in depression research

10. Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014

11. Jürgen Wess et al, Trends Pharmacol Sci.2013


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