Int J Med Sci | 斑马鱼模型首次证实TIE2基因突变可导致多种畸形


2018年2月12日,《Int J Med Sci.》 杂志在线发表了上海交通大学附属第九人民医院-口腔颌面-头颈肿瘤科王延安课题组的合作成果“Transgenic Expression of A Venous Malformation Related Mutation, TIE2-R849W, Significantly Induces Multiple Malformations of Zebrafish ”,首次在斑马鱼体内实验证实:人类TIE2基因突变(TIE2-R849W突变体)会导致斑马鱼尾部静脉融合、颌面骨骼缺陷、眼睛发育缺陷等多个表型。


研究背景

  • 静脉畸形(Venous malformation,VM)是一种血管形态发生缺陷。在遗传性静脉畸形——多发性皮肤粘膜静脉畸形(VMCM)中发现,TIE2基因第2545位碱基C>T导致在胞质内结构的第849位氨基酸R>W突变,是最为常见且独特的突变,被认为是致病的关键。

  • TIE2或TEK(内皮特异性受体酪氨酸激酶(RTK))是调节血管生成和心血管发育的重要组成部分,因此TIE2和VM之间的关系备受关注。虽然早前的体外研究发现TIE2-R849W导致突变TIE2的组成型配体非依赖性超磷酸化,从而激活下游信号通路并增强相应的细胞功能,但TIE2-R849W在体内是否直接导致临床的遗传性静脉畸形表型,至今尚无相关动物模型来证明。

  • 由于Tie2敲除纯合子小鼠胚胎致死、血管网畸形导致内皮细胞显着减少、以及心脏缺陷,因此转基因小鼠模型的可行性仍值得考量。为更直接快速地研究TIE2点突变在体内的机制,斑马鱼模型提供了一个稳妥简洁的体内研究系统。

斑马鱼模型可以:

  • 快速过表达人类同源基因(突变体或者野生型)

  • 早期胚胎通体透明,便于靶器官观察

  • 体外发育迅速

  • 便于大规模遗传学操作

因此,在斑马鱼中建立TIE2-R849W过表达模型可快速观察潜在表型。


研究结果

构建人TIE2-R849W突变质粒,将TIE2-R849W突变mRNA通过显微注射操作,注射到单细胞期fli1a:EGFP血管绿色荧光转基因斑马鱼胚胎中,建立人突变TIE2-R849W过表达斑马鱼模型(图1A-B)。结果发现,表达了突变的TIE2后,斑马鱼尾部静脉丛(caudal vein plexus, CVP)不能正常形成蜂窝状结构,具有明显缺陷(图1C-D)。定量结果显示,表达突变TIE2-R849W的斑马鱼CVP面积与环数减少了约50%(图1E-F)。说明TIE2-R849W突变对早期血管生成具有直接作用。

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图1. 人源TIE2-R849W过表达斑马鱼模型建立与CVP缺陷表型。


随着斑马鱼发育,TIE2-R849W的表达还引发了严重的眼部缺陷。从背侧和腹侧看,明显存在单侧或双侧无眼鱼(图2A)。与对照组相比,在受精后52小时(hpf),TIE2-R849W组有58.5%(42/73)发生不同的眼部缺陷(图2A-B)。由于TIE2-R849W导致的严重畸形(眼部及下文所示的其它畸形),TIE2-R849W过表达斑马鱼死亡率非常高、且生长困难,因此无法用成年斑马鱼来进行常规的组织切片观察。故而在7dpf收集斑马鱼幼鱼,进行组织学分析,发现与对照组相比,TIE2-R849W表达导致斑马鱼眼睛明显缩小(图2C)、晶状体损伤(用绿色星号表示),异常网状层(用黄色星号表示)和仍然可辨认的分离层结构。

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图2. 人TIE2-R849W突变体引起斑马鱼明显的眼部缺陷。


除了眼部缺陷之外,TIE2-R849W突变组(n = 55)7dpf时,还观察到显著的前脑和下颌畸形,而对照组的胚胎全部可正常发育(图3A-D)。从剖面图比较(图3C-D),尽管前脑和下颌骨结构明显异常,不过鼓室发育正常。此外,从形态学分析来看,TIE2-R849W突变体导致下颌向下前部发展、下颌宽度减小、整体形态异常和轻度双颌偏离(图3E-F)。柱状图(图3G)显示与对照组相比,突变体组中25.4%的胚胎(14/55)表现出明显的发育性颚缺陷。对7dpf 斑马鱼头部的组织学研究发现,TIE2-R849W组斑马鱼下颌软骨异常延伸、脑内异位增生和神经胶质细胞的异常定位(图3H-I)。根据前人的研究,下颌和前脑缺陷表型暗示了TIE2和WNT信号通路之间可能存在重要联系。

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图3. TIE2-R849W突变导致前脑畸形和斑马鱼下颌异常发育延长。


对TIE2-R849W突变体过表达斑马鱼模型进行信号通路研究。结果发现,与之前的体外实验结果相一致,TIE2-R849W突变体过表达导致pik3r2和foxo1b表达上调(图4A);与CVP相关的转录因子egfl7有明显上调,而cd146,nr2f1a和s1pr1的表达与对照组相比没有显着差异(图4B)。说明egfl7在TIE2-R849W突变导致的静脉畸形中可能发挥重要作用。

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图4. 通过qRT-PCR检测pik3r2,foxo1b和CVP相关基因在突变组与对照组中的表达水平。


分析与前脑畸形相关的wnt途径相关基因的表达水平(图5A)发现,包括wnt8、gsk-3β、dkk1b、β-catenin在内的几乎所有被测基因都有显著上调。由这些结果,总结出图5B所示信号通路示意图。Wnt信号通路下游β-catenin的高表达可能是各种畸形产生的基础。这意味着TIE2-R849W突变体对WNT信号的调节不仅通过磷酸化的PI3K30,而且上调WNT。对早前的一项研究中分别表达野生型TIE2和多种VM致病突变体TIE2的HUVEC细胞基因芯片表达谱(GSE46684)进行分析(图5C),在突变体-1组中, pik3、egfl7、foxo1、wnt9a、lrp5和dkk1均有较高水平的表达。然而,与对照组相比,突变体-2和突变体-3则没有显着差异。

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图5. 通过qRT-PCR和芯片分析wnt相关基因的表达水平。


此项研究首次在斑马鱼体内实验证实:人类TIE2基因突变(TIE2-R849W突变体)会导致斑马鱼尾部静脉丛异常融合,还导致斑马鱼眼部、前脑、下颌发生严重畸形。结合对相关信号通路的分析结果,体内外实验都指出EGFL7和WNT信号通路在TIE2-R849W相关的调控途径中发挥重要作用。然而,要阐明具体作用机制,仍需进一步深入研究。


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