肝脏研究常用疾病模型


说到肝脏,大家想到的是什么

是挂在嘴边“肝到天明”的口头禅

是体检不合格项目的常客“脂肪肝”

还是肝脏独一无二的再生能力?

......


毫无疑问,肝脏这个词大家都是不陌生的,但对于肝脏本身大部分人就知之甚少了。实际上,我国是一个肝病大国,平均每12个人里就有一个肝病患者,众多肝脏疾病的发病机理和治疗药物还有待探索。今天是世界肝炎日,小编就为大家介绍几种常见的肝脏疾病和常用的动物模型,助大家在研究中快人一步。



01


 肝脏简介


人的肝脏位于上腹部,上与右肺、心脏相邻,下与胃、十二指肠相邻,肝是人体最大的消化腺,也是体内新陈代谢的中心,据估计,在肝脏中发生的化学反应有500种以上。肝脏承担着营养代谢、解毒排毒、分泌胆汁、免疫防御等多种重要的生理功能。

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肝脏承担的生理功能重要且繁多,是比较容易“积劳成疾”的器官之一,我国各类肝病的患者加起来有1亿多人。常见的肝病包括:脂肪肝、肝实质细胞损伤、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化和肝癌等。动物模型对于研究肝脏异常和肝脏疾病的病理生理机制,以及确定有效的治疗方法和筛选潜在的生物标志物至关重要。下面,小编为大家分别介绍肝脏研究常用的小鼠模型。



02


脂肪肝模型


脂肪肝,大家都不陌生,谁还没个患脂肪肝的朋友呢...


肝脏是人体的营养中转站,吃下去的食物被消化吸收后会进入肝脏进行代谢。如果吸收的脂肪超过了肝脏的处理能力,它们就会沉积在肝内,形成脂肪肝,脂肪肝一般分为酒精性脂肪肝(Alcohol-related liver disease,ALD)和非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)两大类。


 2.1酒精性脂肪肝模型   


酒精摄入后,少量会立即在胃中代谢,剩余的大部分酒精会被胃肠道吸收,随后通过静脉输送到肝脏。肝脏是酒精代谢的主要器官,它通过几种酶促和非酶促反应机制将90%以上酒精代谢成乙醛[1,2]。乙醛主要由乙醇脱氢酶 (ADH)、细胞色素P450 2E1 (CYP2E1) 和过氧化氢酶产生。乙醛随后被醛脱氢酶 (ALDH) 转化成乙酸,并从肝脏中释放出来,被肌肉和心脏代谢[2]。乙醇本身和它的衍生物乙醛可使肝细胞发生脂肪变性、坏死,摄入的酒精超过肝脏的分解能力会对肝脏造成损伤。ALD模型的构建基本都是通过小鼠长期过量摄入酒精来造模的。

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ALD的主要病理变化


建模小鼠选择:

  • 品系:C57BL/6最佳,BALB/c 及DBA老鼠在造模过程中体重会降低,死亡率较高,不太适用。C57BL/6中,6N又要比6J更易感(6J的乙醛脱氢酶水平较高,酒精代谢较6N好)。

  • 性别:雌鼠更适合用于酒精性脂肪肝的造模,因为雌鼠胃乙醇脱氢酶水平低,同时雌激素让肝Kuffer细胞更容易受到 LPS 和促炎症因子的影响。

  • 周龄:8-11周龄的老鼠(成年鼠)比较适合用于造模,老年肝细胞内乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和CYP2E1活性均降低,更易成模。


建模方法:

  • 直接在饮用水中加酒精造模:饮用水乙醇量通常开始从5%(v/v)开始逐步提高,小鼠可提高到25.32% (v/v) 的浓度。一般8-10周肝脏出现脂肪变性,长期(数月)酒精喂养可诱发氧化应激、脂肪变性、轻微的纤维化、炎症细胞浸润、肝损伤等。


  • Lieber-DeCarli液体酒精鼠粮造模:市面上有各种品牌的特制鼠粮可用于ALD造模。一般来讲,喂食4周小鼠肝脏出现轻度脂肪变性,转氨酶轻微升高,少量炎症。喂食8-12周出现明显的脂肪肝,伴有轻度炎症和肝脏损伤,但是一般没有纤维化[6]


  • 胃内插管造模:上述造模方法只能得到早期ALD模型,为了模拟晚期ALD,1984 年 Tsuka moto和同事尝试了一种新方法,直接通过手术将插管植入小手术胃内,研究者借此可以完全控制小鼠乙醇摄入量。通过长期将小鼠血液中的酒精维持在250–500 mg/dl 的水平,可以在小鼠上模拟人类 ALD 的病理变化,包括微泡和大泡脂肪,巨线粒体、细胞凋亡、中央坏死和混合炎性浸润,中央小叶和细胞周围纤维化,门静脉纤维化,桥接纤维化等[7]


  • 水/酒自由选择造模:同时给小鼠提供正常饮用水和含酒精应用水(或不同酒精浓度的饮用水)。因为啮齿动物不会被迫喝酒精来缓解饥饿或口渴,这种方法可以筛选(培养)出小鼠中的“酒鬼”,与人类嗜酒行为更相似。这种模型可以模拟酒精成瘾,用于研究分子和神经化学途径导致酒精滥用的行为和成瘾机制[3]


 2.2非酒精性脂肪肝模型   


伴随肥胖人群的激增,非酒精性肝病(NAFLD)的发病率在过去20年发生了一波爆发式的增长。NAFLD 如果不能得到有效治疗,会逐渐进展到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化(Fibrosis)。此时通过积极干预,肝脏仍可能恢复正常,一旦进展到肝硬化(Cirrhosis),将会有约 1~4% 的患者最终进展为肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。目前的假说认为NASH是多种因素共同作用的后果,包括遗传、肥胖、代谢综合症(比如高血压、高血糖)、心血管疾病、糖尿病等。

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NAFLD/NASH发病特征


食源性肥胖和胰岛素抵抗是最常见的人类代谢疾病的诱因,各类特制饲料常用在NAFLD/NASH造模中。


  • MCD(Methionine- and choline-deficient diet)造模:MCD饮食中缺乏蛋氨酸和胆碱,蛋氨酸是合成半胱氨酸的关键化合物,胆碱是乙酰胆碱的前体,它们是肝脏和成磷脂酰胆碱的必要原料,缺乏磷脂酰胆碱会导致极低密度脂蛋白VLDL无法正常组装,甘油三酯 (TG)无法转运,在肝脏大量积聚。小鼠MCD饮食3周后通常会出现明显的脂肪性肝炎,5-8 周后出现明显的纤维化,10 周后肝脏出现大量坏死性炎症灶,但MCD模型不会出现NAFLD相关的代谢综合征;此外,小鼠喂食 MCD会出现严重的体重下降,8周的喂养会失去约40%的体重,很可能是因为代谢亢进[8]


  • CDAA(Choline-deficient L-amino-defined diet)造模:与MCD饮食相似,CDAA也缺乏胆碱,但是CDAA配方含有少量蛋氨酸,因此CDAA诱导花费的时间比MCD饮食长,约在12周后小鼠会出现NASH并伴有纤维化,21周纤维化可以进展到中期,经常以 CDAA 为食的啮齿动物表现出与纤维化相关的肝肿瘤。相较于MCD造模,CDAA造模进展温和,可用于研究从 NAFLD 到 NASH 再到 HCC 的进展。值得注意的是,这些病变很少出现在雌性小鼠上[9]


  • HFD(High-fat diet)造模:高脂饮食没有人为的减少必要营养成分,只是提高了饲料中的脂肪含量,这可以更好的模拟人类肥胖和NAFLD的发病过程。HFD造模的效果与品系和性别均有关,通常雄性比雌性更容易肥胖;品系上,C57BL/6 比BALB/c更容易成模。事实上,C57BL/6 小鼠自身具有肥胖、高胰岛素血症和葡萄糖耐受不良的遗传背景。


  • HFD衍生造模:在HFD的基础上增减饲料成分,以期达到更好的造模效果。例如,去除HFD饲料中的胆碱choline,或在HFD饲料中添加果糖、胆固醇或反式脂肪酸、化合物CCL4等[3]

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ALD和 NAFLD/NASH 常用模型的主要特征


除饮食诱导外,我们还可以通过基因修饰的方法,敲除Adh, Ldlr等关键基因,阻断脂肪代谢来构建脂肪肝模型,相关的基因修饰模型详见文末表格。


需要注意的是,理想的NAFLD/NASH小鼠模型应该能模拟人类NAFLD/NASH的发病过程,实际上,现有的很多模型仅在组织病理上的变化与临床 NASH 很相似,但是肝脏的代谢、疾病的成因并不相同。例如,MCD和CDAA诱导虽然可以形成与 NASH 相似的病理组织如肥胖、炎症、纤维化,然而,临床 NASH 患者并不会出现胆碱缺乏。此外,MCD小鼠模型会出现体重下降而不是升高的特点,这一点在病理生理学与临床NASH症状相反。



03


肝损伤/肝纤维化/肝硬化模型


肝损伤主要指肝实质细胞的功能损伤或坏死。临床肝损伤主要由饮酒、食物中毒、药物毒性、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化及胆汁淤积症等引起。严重的急性肝损伤可发展为肝衰竭,危及生命;慢性肝损伤则可能向肝纤维化、肝硬化、肝癌的终末期发展。肝纤维化几乎伴随着所有的慢性肝疾病。

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慢性肝病的主要病理变化


肝损伤造模一般通过腹腔注射或小鼠尾静脉注射特定化合物(如:CCl4、APAP、ConA、LPS&D-GalN等)即可,造模周期短。通常肝损伤模型构建数小时后,小鼠即出现急剧的肝细胞死亡、肝衰竭乃及死亡;而低剂量重复注射化合物则可以缓慢积累肝损伤,导致肝纤维化、肝硬化的产生。


  • CCl4诱导:不同剂量的四氯化碳(CCl4)可分别造成小鼠急性或慢性肝损伤发生。高剂量CCl4在肝细胞内经过细胞色素p-450依赖性途径产生有肝脏毒性的自由基代谢产物,从而导致肝损伤;低剂量、多次数的CCl4注射能够导致肝细胞变性、坏死以、肝脏纤维化及肝硬化发生。


  • APAP诱导:由于临床上对乙酰氨基酚(APAP)的过量使用是导致病人肝毒性的重要因素,因此,小鼠口服高剂量的APAP也是常用的诱导肝损伤的模型。


  • LPS与D-GalN诱导:该模型主要用于研究巨噬细胞作用机制。D-GalN(D-galactosamine,半乳糖苷)作为一种特异性的肝脏致敏剂,能够参与肝细胞代谢并特异地消耗尿嘧啶,从而抑制细胞的转录活性,导致NF-κB下游靶基因不能正常表达发挥抗凋亡作用。腹腔联合注射LPS和D-GalN常作为研究巨噬细胞分泌的TNFα诱导急性肝损伤的经典模型。


  • ConA诱导:ConA(刀豆蛋白)作为一种T细胞丝裂原,能够激活NK细胞释放IFN-γ,促进T细胞活化,从而导致急性肝损伤发生。目前被广泛应用于研究 NKT 细胞在肝脏损伤中作用机制。

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ConA作用机制


  • Fah敲除模型:化学物质诱导肝损伤通常是剧烈且不可逆的,不能模拟临床非化学肝毒性因素的肝损伤的病理状态和机制,也无法观察从肝损伤到肝硬化这一渐变过程。通过敲除关键基因构建慢性肝损伤模型可以克服这个问题,并可获得大量特性均一的动物模型,如Fah-KO小鼠(NM-KO-191202),它敲除了延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetatehydrolase,Fah)。正常情况下,酪氨酸最终代谢为延胡索酰和乙酰乙酸。Fah基因敲除后,产生有毒的延胡索酰乙酰乙酸盐和马来酰乙酰乙酸,并产生其次级代谢产物丙酮,对肝、肾造成损伤,引起肝脏损伤和肝硬化[4]



04


病毒性肝炎模型


病毒性肝炎(viral hepatitis)是由多种不同肝炎病毒引起的一组以肝脏损害为主的传染病,可分为甲、乙、丙、丁、戊、庚六种类型。其中,乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎,多经输血或血制品以及密切接触传播,易迁延发展成慢性甚至肝硬化,已证实乙型(HBV)和丙型(HCV)肝炎病毒感染与肝癌有一定关系。在此主要介绍HBV和HCV小鼠模型。

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病毒性肝炎分类


 4.1 HBV小鼠模型   


常见HBV小鼠模型造模方法如下:

  • lHBV病毒注射:将 HBV 质粒 DNA 直接注射到小鼠体内,这种造模方法可以制作不同毒株的模型,缺点是稳定期短。

  • AAV转染:腺病毒包装HBV基因组,再进行注射,这种方法能形成与临床相似的免疫耐受,但是小鼠无法重复感染。

  • 人乙肝组织移植:目前最完备的HBV感染模型,可在小鼠上模拟人HBV感染,缺点是手术复杂,重复性差。

  • 转基因小鼠:通过基因工程技术,将HBV基因组敲入小鼠基因组,小鼠模型可终生表达HBV,这种模型的优点是稳定性高重复性好,缺点是无法模拟临床感染过程,无法根除HBV。


南模生物将c1型HBV病毒1.0拷贝全长DNA转入小鼠,构建了携带HBV病毒的转基因小鼠HBV-Tg(货号:NM-TG-00003)。该转基因小鼠血清中HBsAg呈阳性,但无HBeAg、anti-HBs、anti-HBe或antiHBc表达,无HBV DNA复制。在该转基因小鼠模型的血清、肝脏和肾脏中可以检测到稳定表达的人乙肝病毒表面抗原,该小鼠模型为研究人类“乙型肝炎”的发病机制、治疗方法与药物筛选,提供了理想的动物模型和新型研究手段,具有重要的医药应用价值。

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免疫组化检测HBsAg在肝脏(A)和肾脏(B)中的表达


 4.2 HCV小鼠模型   


HCV只能感染灵长类,长期以来都没有可用的小动物模型。将 HCV 在人肝细胞膜表面表达的受体基因转入小鼠,可使小鼠感染 HCV,例如人源化小鼠的CD81和OCLN基因(南模货号:NM-HU-2000107),可使HCV病毒正常感染小鼠肝脏[10]。还有研究发现,应用人源化肝脏小鼠也可以建立HCV感染小鼠模型[5]。


鉴于灵长类和啮齿类在病毒易感性和感染机制上的差异,病毒模型更多的采用食蟹猴作为模式动物。但在前期的研究中,综合考虑成本等方面的因素,也可以选择免疫缺陷小鼠注射相应病毒来造模。



05


肝癌模型


肝癌的发生是一个多阶段逐渐演变恶化的过程,从最初的肝炎到肝硬化,再到最后的肝癌,是一个多步骤的发展过程。肝癌模型的构建方法较多,可以用化学致癌剂诱导,可以移植肝癌细胞或组织建模,还可以通过修饰关键抑癌基因或原癌基因造模。

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肝脏病变进展


 5.1诱发性肝癌模型   


许多化学致癌剂达到足够的剂量及时间可诱发动物形成肿瘤。常用的肝癌诱导剂包括:二乙基亚硝胺(DEN)、黄曲霉素B1(AFB1)、四氯化碳(CCl4)等。

诱发性肝癌模型优点:可以模拟肿瘤发生的3个过程,即损伤,硬化和肿瘤。

诱发性肝癌模型缺点:诱导周期长,致死率高,个体间肝癌发生的时间、部位及病灶数等不均一。


 5.2 移植性肝癌模型   


移植性肝癌小鼠模型是指将小鼠或人的肝癌组织、细胞株或其他恶性肿瘤(如乳腺癌)移植到小鼠体内形成的动物模型。是肝癌研究常用的模型之一,适用于抗癌药物临床前的药效评价。

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PDX模型


目前,常见的移植性肝癌模型主要分为两种,一种是将人源的肝癌细胞系(HepG2, Hep3B, SMMC-7721, HuH7等)接种到免疫缺陷小鼠体内,称为CDX模型(cell-line-derived xenograft),另一种是将来源于患者的肝癌组织块接种到免疫缺陷小鼠体内,称为PDX模型(patient-derived xenograft),南模生物已累计构建了近百种肝癌PDX模型。


 5.3 基因修饰肝癌模型   


利用基因工程手段构建的肝癌小鼠不仅能从动物整体的组织器官水平上进行研究,而且还可以深入到细胞和分子水平,为肝癌的发病机制、药物筛选和临床医学研究提供理想的实验动物模型,南模生物自主构建了多种敲除,条件性敲除的肝癌小鼠模型,模型信息详见文末表格。

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南模生物深耕基因编辑领域,提供全方位模式生物服务,包括基因修饰成品模型供应、个性化模型定制、饲养繁育、表型分析、药效评价等,满足不同实验室需求。


参考文献:


1.Ramchandani, V.A.; Bosron, W.F.; Li, T.K. Research advances in ethanol metabolism. Pathol. Biol. (Paris) 2001, 49, 676–682.

2.Crabb, D.W.; Matsumoto, M.; Chang, D.; You, M. Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol-related pathology. Proc. Nutr. Soc. 2004, 63, 49–63.

3.Nevzorova YA, Boyer-Diaz Z, Cubero FJ, Gracia-Sancho J: Animal Models for Liver Disease - A Practical Approach for Translational Research. J Hepatol 2020.

4.R. Berger, G. P. Smit, S. A. Stoker-de Vries, M. Duran, D. Ketting, and S. K. Wadman, 'Deficiency of Fumarylacetoacetase in a Patient with Hereditary Tyrosinemia', Clin Chim Acta, 114 (1981), 37-44.

5.Humanized Mouse Models for the Study of Hepatitis C and Host Interactions.Cells. 2019 Jun; 8(6): 604, Pages 1-27.

6.Lamas-Paz A, Hao F, Nelson LJ, Vazquez MT, Canals S, Gomez Del Moral M, et al. Alcoholic liver disease: utility of animal models. World J Gastroenterol 2018;24:5063–5075.

7.Tsukamoto H, Reidelberger RD, French SW, Largman C. Long-term cannulation model for blood sampling and intragastric infusion in the rat.Am J Physiol 1984;247:R595–R599.

8.Corbin KD, Zeisel SH. Choline metabolism provides novel insights into nonalcoholic fatty liver disease and its progression. Curr Opin Gastroenterol 2012;28:159–165.

9.Farrell G, Schattenberg JM, Leclercq I, Yeh MM, Goldin R, Teoh N, et al.

Mouse models of nonalcoholic steatohepatitis: toward optimization of their relevance to human nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2019;69:2241–2257.

10.J Virol . 2017 Jan 31;91(4):e01799-16. doi: 10.1128/JVI.01799-16. Print 2017 Feb 15. Mice Expressing Minimally Humanized CD81 and Occludin Genes Support Hepatitis C Virus Uptake In Vivo Qiang Ding, Markus von Schaewen, Gabriela Hrebikova, Brigitte Heller, Lisa Sandmann, Mario Plaas, Alexander Ploss.




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