Circulation | 利用DeaLT技术揭示成人心肌细胞再生的来源

2018-05-03 10:47 by 南模生物


4月26日,国际学术期刊《Circulation》在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组的研究成果“Genetic Lineage Tracing of Non-myocyte Population by Dual Recombinases”。该研究工作利用新建立的双同源重组技术(DeaLT)揭示了在胚胎心脏发育、成体心脏稳态维持及损伤修复、成体骨骼肌稳态维持和损伤修复过程中,非肌肉细胞分化形成肌肉细胞的潜能。

南模生物为该研究构建了超过15种小鼠模型。


Highlight

待解决问题:如何排它性地分别标记非肌肉细胞和心肌细胞?

解决方法:

利用DeaLT 双同源重组示踪报告基因系统(Dual-recombinase-activated lineage tracing)将 Dre-rox 重组系统与传统的 Cre-loxP 重组系统结合起来,交错的 loxP 和 rox 位点可以在 Cre-loxP 或 Dre-rox 重组后切除另一套重组系统,在可能引起重组酶异位表达的细胞中将另一套重组酶的识别位点切除掉,从而有效地阻止异位重组,使细胞排它性地被标记上 ZsGreen 或 tdTomato 荧光,增加谱系示踪结果的准确性。

根据 loxP 和 rox 的位置顺序不同,分为 IR 和 NR 两种报告基因系统。

方案一:IR

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  • 先用心肌细胞Marker的Dre使心肌细胞被标记上tdTomato红色荧光;

  • 再用诱导型Cre,在药物诱导后表达Cre重组酶,将除了心肌细胞以外的所有非心肌细胞都永久标记上ZsGreen绿色荧光;

  • 如果非肌细胞向肌细胞转化,那么由非肌细胞转化而成的新生心肌细胞将是ZsGreen绿色荧光标记的。所以只需要在心肌再生过程中寻找是否有带绿色荧光的心肌细胞即可。

方案二:NR

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  • 首先心肌细胞Marker的Dre和广泛型表达的Cre将细胞分为两类,一类是表达tdTomato红色荧光的肌细胞,一类是表达ZsGreen绿色荧光的非肌细胞;

  • 如果发生非肌细胞向肌细胞的命运转化,那么在新肌细胞生成过程中,心肌细胞Marker的Dre会介导原来绿色荧光标记的细胞被标记上tdTomato红色荧光,因此会同时存在绿色和红色两种标记均阳性的新生肌细胞,产生黄色荧光信号。


研究背景

心脏作为脊椎动物最重要的器官之一,主要功能是为血液流动提供动力。心脏发生心肌梗塞后造成心肌细胞大量死亡,心脏功能受到影响。成体心脏是否存在心肌干细胞一直存在争论,之前的研究利用传统的遗传谱系示踪技术认为在成体心脏中存在心肌干细胞,例如Kit+心肌干细胞、Bmi1+心肌干细胞、Scal1+心肌干细胞、Islet+心肌干细胞等,但由于这些心肌干细胞的分子标记本身就表达于部分心肌细胞中,因此这些假设的心肌干细胞向心肌细胞的分化潜能仍受到质疑。

在最新的这篇研究成果中,研究人员利用双同源重组技术同时对肌肉细胞和非肌肉细胞进行谱系示踪,系统揭示非肌肉细胞向肌肉细胞分化的潜能.


标记非肌肉细胞的新示踪技术

为了明确非肌肉细胞中是否存在假定的心脏干细胞CSC,研究人员设计了标记所有非肌肉细胞谱系的新系统。利用DeaLT-IR1报告基因小鼠(见下图),交错的loxP和rox位点可以在Cre-loxP或Dre-rox重组后切除另一套重组系统,从而使细胞排它性地被标记上ZsGreen或tdTomato荧光。


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如何利用该系统来分别标记肌细胞和非肌细胞呢?需要将 Tnnt2-Dre(Tnnt2是心肌细胞Marker)、R26-iCre(由R26-rtTA与TRECre交配获得,可在强力霉素 Dox 诱导下表达 Cre)和 IR1报告基因小鼠3种小鼠交配在一起,获得 Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠:Tnnt2-Dre首先标记表达Dre的肌细胞;并且在强力霉素(Dox)处理后,R26-iCre 标记除肌细胞外的所有细胞(图1A,B)。该双同源重组系统中用tdTomato来标记肌细胞、用ZsGreen来标记非肌细胞。

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图1. A-B


先,用这套系统研究在胚胎心脏中非肌细胞向肌细胞的转化。在胚胎心脏发育早期,Isl1+的心肌干细胞可以贡献第二心区的心肌细胞,例如,心脏的流出道,右心室部分的心肌细胞,以及左心室和心房非常少量的心肌细胞均来自于Isl1+的心肌干细胞(图1C)。Isl1-CreER;R26-tdTomato小鼠在E8.0天给予他莫昔芬诱导,在E13.5天右心室被标记上红色荧光(图1D)。

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图1. C-D


Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠在E8.0天给予Dox诱导标记非肌细胞,发现在E8.5天时在其他组织中被标记上ZsGreen绿色荧光,心肌为红色荧光标记(图1E)。接下来收集E13.5天的心脏组织,发现dTomato、ZsGreen和TNNI3(肌细胞marker)的免疫染色显示E13.5天右心室中的大多数肌细胞是被ZsGreen绿色荧光标记的,说明在胚胎心脏发育早期,非心肌细胞具有分化形成心肌细胞的能力,这些非心胞可以贡献形成第二心区的心肌细胞(图1F),证明了新的示踪系统可以有效检测发育中的心脏非肌细胞向心肌细胞的转化。

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图1. E-F


揭示非肌肉细胞转分化的 4 种策略

策略1 Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1 非肌细胞对成体心脏中的肌细胞没有贡献

使用Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠来同时追踪成体心脏中的心肌细胞和非心肌细胞。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色显示tdTomato+细胞是TNNI3+心肌细胞,而ZsGreen+细胞不是TNNI3+心肌细胞(图1G)。 分离Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1的心肌细胞进行体外观察也没有检测到ZsGreen+心肌细胞(图1H)。 因此,Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1系统用两种不同的荧光标记了肌细胞和非肌细胞(图1I)。

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图1.G-I


非肌细胞在成体心脏中是否会分化成肌细胞呢?如果是,那么源自非肌细胞的新心肌细胞将是ZsGreen+的。而实验结果是:在Dox诱导后,对Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠进行结扎左前降支冠状动脉诱导MI造模(图2A)。心肌梗塞后,造成心肌细胞大量死亡,心脏功能受损,在损伤后2-4周,对心脏切片进行ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色,结果没有发现ZsGreen+TNNI3+的心肌细胞(图2B)。在5个心梗组织的600多个切片中,都没有检测到ZsGreen+tdTomato-心肌细胞。流式细胞分析(图2D)和荧光显微镜(图2E)也证实在Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的MI造模后的心脏中也没有观察到ZsGreen+心肌细胞。RT-PCR结果也只有tdTomato的表达,没有ZsGreen的mRNA表达(n=5,图2F)。这些数据表明,非心肌细胞在成体心脏的心脏损伤后对肌细胞没有贡献。

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图2. A-F


平行地,将骨骼肌损伤后骨骼肌中非肌细胞向肌细胞的细胞命运转化作为阳性对照。骨骼肌在稳态维持过程中,肌纤维细胞与非肌肉细胞发生融合,肌纤维细胞处于多核状态,因此在正常骨骼肌(假手术组)中,可以检测到tdTomato+ ZsGreen+肌细胞(图2G)。而当对Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的胫骨前肌(TA肌)实施BaCl2损伤后,骨骼肌中肌纤维细胞大量死亡,TA肌损伤后可以检测到弱tdTomato荧光信号和强ZsGreen表达,表明在BaCl2造模后ZsGreen+细胞逐渐取代tdTomato+细胞(图2G)。与假手术组相比,在受损TA肌中可以检测到ZsGreen+tdTomato-肌细胞(箭头,图2G),说明非肌细胞重新形成肌细胞。

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图2. G


综合上述结果,通过Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1(策略1)的双同源重组谱系示踪技术揭示了在胚胎心脏和成体骨骼肌中非肌细胞向肌细胞的转化,但在成体心脏中非肌细胞对肌细胞没有贡献。


策略2 Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3 反向Cre/Dre 系统在非肌细胞向肌细胞转化研究中标记两种细胞

设计第2个双同源重组谱系示踪系统用来验证非肌细胞向肌细胞的转化。该系统由Tnnt2-Cre(肌细胞中表达Cre)、他莫昔芬诱导型 R26-DreER 和IR3报告小鼠组成。利用IR3报告小鼠(见下图)可排它性地将非肌细胞标记上tdTomato红色荧光,将肌细胞特异性地标记上ZsGreen绿色荧光。

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Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠就可以同时标记肌细胞(ZsGreen+)和非肌细胞(tdTomato+)(图3A)。 

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图3. A


胚胎E8.0天心脏中ZsGreen主要标记原始心管(图3B)。E8.0天给予他莫昔芬诱导,在E13.5天的右心室中发现tdTomato+非肌细胞对肌细胞有显著贡献(图3C)。心脏切片免疫染色也证实了此结果(图3D-F)。

同样,在成体心脏和骨骼肌中,通过MI和BaCl2造模来观察非心肌细胞的命运转化(图3G)。分离的心肌细胞的流式细胞分析(图3H)和荧光显微镜(图3I)分别结果也都显示没有tdTomato+心肌细胞。在形态上,这些tdTomato+细胞与ZsGreen+心肌细胞也明显不同(图3J)。 

tdTomato和TNNI3免疫染色显示这些tdTomato+细胞在MI心脏的梗塞区、边界区和远端区均不会转化为TNNI3+心肌细胞(图3K)。来自5个Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠心脏的超过600个组织切片中均未检测到tdTomato+TNNI3+心肌细胞。RT-PCR结果也同样指出分离的心肌细胞只表达ZsGreen,不表达tdTomato(图3L)。

相反,在阳性对照实验中,TA肌损伤模型中他莫昔芬诱导后可以很容易地检测到tdTomato+ZsGreen-肌细胞(箭头,图3M),而假手术组没有。

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图3. 


综合上述结果,第2种策略使用Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3也显示出与策略1一致的结果:非心肌细胞在胚胎心脏和成体骨骼肌中转化为肌细胞,但在成体心脏中对肌细胞没有贡献。


策略3 Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1

为了进一步验证上述发现,使用另一种肌细胞Marker——TNNI3来驱动Dre重组酶。 Tnni3-Dre在成体心脏中有效且特异性标记肌细胞,但不标记非肌细胞。利用Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠,分别标记肌细胞和非肌细胞(图4A)。

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图4. A


通过ZsGreen、tdTomato和不同心脏细胞谱系marker的免疫染色显示肌细胞表达tdTomato、非肌细胞(例如内皮细胞、成纤维细胞等)表达ZsGreen(补充材料)。不给予Dox诱导的情况下,在Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠中未观察到ZsGreen+细胞组织(图4B)。

给予Dox后两周,进行MI或BaCl2注射(图4C),结果发现在假手术的心脏中,Dox诱导后使tdTomato+心脏细胞也被标记上ZsGreen绿色荧光(图4D)。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色显示所有心肌细胞均为tdTomato+ZsGreen-(图4E)。MI造模后,梗塞的心脏组织中tdTomato+肌细胞数量明显减少,被ZsGreen+非肌细胞替代(图4F)。

分离MI造模后的心肌细胞体外观察均为tdTomato+ZsGreen-细胞(图4G)。 tdTomato、ZsGreen和TNNI3免疫染色显示ZsGreen+细胞在损伤后并没有转向心肌细胞命运(图4H,I)。通过分流式细胞分析和RT-PCR没有检测到MI心脏中有任何ZsGreen+tdTomato-肌细胞(图4J,K)。

相反,在阳性对照实验中,在损伤的TA肌肉中可以检测到ZsGreen+tdTomato-肌细胞(箭头,图4L),表明非肌细胞新生为肌细胞。

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图4. 


所以,基于Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1的第3种模型也揭示了在成体心脏中非肌细胞并不转化为肌细胞。


策略4 Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1 通过NR1系统研究非肌细胞向肌细胞的转化

虽然利用广泛型启动子驱动的可诱导Cre或Dre可以有效标记大多数非肌细胞,但实际上标记效率并未达到100%。少数未标记的非肌细胞在损伤后在成体心脏中产生新的肌细胞也仍旧是有可能的,虽然可能性并不大,因为在谱系示踪期间的标记过程是完全随机的。为了达到100%的非肌细胞标记效率,利用NR报告基因小鼠(见下图),设计了第4种策略。

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在这个系统中,ZsGreen标记小鼠所有的细胞,除了被tdTomato标记的新形成的肌细胞。Actb-Cre-loxP重组之后NR1小鼠中的所有细胞首先被标记为ZsGreen绿色荧光,只有新的肌细胞在形成时由于第二个Tnnt2-Dre-rox的重组而开启tdTomato红色荧光的标记(图5A)。绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞中有12-24小时的半衰期,所以尽管肌细胞中的Dre-rox重组会导致tdTomato表达,但ZsGreen蛋白在降解前仍有稳定的标记时间。因此可以在非肌细胞向肌细胞转化期间检测到双阳性细胞。

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图5. A


首先分析之前实验中的胚胎心脏(图5B)来测试这个系统。很容易在E8.5天发育的心脏流出道中检测到tdTomato+ZsGreen+肌细胞(箭头,图5C),这与以前的研究结果一致,表明第二心区祖细胞在这个阶段分化成心肌细胞。

然后,在MI造模28天期间每12小时间隔收集小鼠心脏样本进行分析(图5B)。对于ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色,结果显示在梗塞心肌中没有ZsGreen+tdTomato+肌细胞(图5D)。所有56个时间点的Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心脏样本,超过6000个心脏切片中未检测到任何ZsGreen+tdTomato+肌细胞。类似地,分离心肌细胞进行流式细胞分析在ZsGreen+细胞中也没有发现肌细胞(图5E)。

相反,阳性对照实验中很容易在受损TA肌肉中检测到ZsGreen+tdTomato+肌细胞(图5F)。在Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心脏切片中非肌细胞100%被ZsGreen标记(补充材料)。

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图5.


综上所述,使用基于Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1的第4种谱系示踪策略的结果显示,非肌细胞向肌细胞的转化只在胚胎期而不在成体心脏中出现。

不同心脏细胞谱系对肌细胞的贡献

除了成体心脏中的心肌细胞外,还有多种具有已知分子标记的非肌细胞细胞谱系。对于这些不同的细胞群,用不同的Marker启动子驱动重组酶构建工具鼠,来追踪非肌细胞的细胞命运,如:

  • 内心细胞:Npr3-CreER;

  • 间充质干细胞或成纤维细胞:Sox9-CreER、Vim-CreER、Postn-CreER;

  • 内皮细胞:Cdh5-CreER;

  • 周细胞或平滑肌细胞:Myh11-CreER、Pdgfrb-CreER、NG2-CreER;

  • 心外膜细胞:Wt1-CreER;

作为对照,用aMHC-MerCreMer来示踪心肌细胞。

对这10种工具鼠进行他莫昔芬诱导,两周后进行MI造模或假手术,并在心脏损伤4周后收集心脏组织样本(见下图B)。在这10个小鼠品系的心脏切片上的tdTomato和肌细胞标记TNNI3染色显示,在假手术或MI后除了来自已存在的心肌细胞外,并没有来自上述这些不同细胞谱系对肌细胞的贡献(下图C,D)。这些结果表明,所有这些非肌细胞都不参与向新的肌细胞转化,而aMHC-MerCreMer示踪数据显示,受损心肌中的所有心肌细胞均来源于已有的心肌细胞(下图C,D)。

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图6. A-D


研究结论

因此,综合所有的实验结果,心肌再生中肌细胞生成肌细胞,而不存在非肌细胞向肌细胞的转化。


利用新建立的双同源重组技术系统的这项研究,由哪些临床意义呢?

  • 表明假定的Sca1+,Bmi1+,Isl1+,Abcg2+或其他干细胞群体在成体阶段对于心脏再生并不具备生肌潜能。

  • 心肌细胞是心脏再生的主要细胞来源。

  • 这种新的遗传学系统提供了前所未有的策略,来研究假定的成体干细胞对组织修复和多器官系统再生的贡献。


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